Saturation BSA pour purif de protéine His-tagged

[invitea0443c8c]

Salut!
J'utilise actuellement de la résine TALON Metal Affinity de chez Clontech pour purifier des protéines His taggées.
J'étudie l'addition d'une protéine His taggée que j'apellerai H sur une autre protéine que j'apellerai P (désolé de rester si obscure mais ces recherches sont assez nouvelles et rien n'est publié pour le moment ).
Or il s'avère que lors de nos purifs, nous obtenons certes la protéine P couplée à H (=His) (donc rien d'anormal) mais également une grosse quantité de protéine P seule sans l'autre protéine couplée à l'histidine (la taille de la bande le confirme), ce qui n'est pas normal (bien que l'on surexprime P et H).
Donc je me demande si on ne pourrai pas enlever ce "bruit de fond" (qui ne doit pas partir totalement car les protéines sont surexprimées mais qui doit quand même fortement diminuer) en saturant la résine avec 1% BSA avant l'incubation avec les échantillons....

Donc voilà juste pour voir si certains d'entre vous ont déjà eu ce genre de problèmes, avec ce type de résine ou pas, et si oui comment ils l'ont résolu (si ils l'ont résolu ).

A+ et merci pour les réponses éventuelles!

Vinc
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[invitea0443c8c]

Alors aucune idée??

Vinc

[invite84b0382c]

Salut Vinc,

La question est bête et je pense que tu as déjà pensé à ca mais le site de liaison n'est il pas génant au niveau structure 3D pour empêcher la liaison ?

Je pensais à une modification de structure: certaines protéines prennent une conformation particulière selon le pH ou d'autres facteurs

Ton point est quand même très pointue. C'est sans doute pour ca que tu n'as pas encore eu de réponse

Akïn

[invitea0443c8c]

Salut!
Merci pour ta réponse!

La question est bête et je pense que tu as déjà pensé à ca mais le site de liaison n'est il pas génant au niveau structure 3D pour empêcher la liaison ?
Je pensais à une modification de structure: certaines protéines prennent une conformation particulière selon le pH ou d'autres facteurs

Je ne vois pas trop ce que tu veux dire.... Mon problème est que ma résine accroche une protéine qui n'est pas liée à une autre protéine His taggée. En gros c'est un problème de liaison à des protéines non spé.

J'ai testé une purif en saturant une demi heure avec de la BSA 1% et je fais actuellement mon Western et mon ECL : début de résultats dans la journée, en espérant avoir perdu un peu de non spé.
Je vous tiens au jus (pour ceux que ça intéresse )

A+
Vinc

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite84b0382c]

Salut Vinc,

En fait, ce que je sous entendais, c'est que, s'agissant de protéines, leur liaison soit rendu partiellement impossible de part un encombrement stérique dû à un changement de conformation.

Comme je te le disais, certaines protéines sont dépendantes de certains facteurs (pH ambiant par exemple). Je posais donc l'hypothèse que ton pH (toujours par exemple) soit un peu limite et que certaines protéines aient acquis une autre conformation rendant la liaison des deux sites impossible. Tu me suis là ?

Par contre, en relisant, je ne saisi pas laquelle de tes deux protéines est lié à ta colonne ?

Akïn

PS: J'ai demandé dans mon labo d'autres façon de procéder pour saturer des sites non spécifique (je me suis pas étalé sur le sujet) et on me parle de lait écrémé à 5%. As tu déjà essayé ?

[invitea0443c8c]

Salut!
Non mais je pense que je me suis mal exprimé.... Je retrouv ebien la liaison là où je dois l'avoir donc pas de problème à ce niveau là. Mon souçis vient du fait que là où je ne peux pas avoir d'interaction avec une protéine His taggée (vu que je ne l'ai pas transfectée et qu'elle n'est pas assez présente dans la cellule à l'état endogène), je descend quand même ma protéine non liée à une 6His....alors que la résine ets sensé me descendre uniquement ce qui est lié à l'histidine!
Non on a pas essayé le lait 5% mais j'y ai pensé (vu que c'est ce qu'on utilise pour les blots). Si la BSA marche pas je verrai....
Disons que c'est un problème qui dérange personne à part moi, vu que sur le papier on coupera cette bande non spé. Mais étant d'un naturel perfectionniste et n'acceptant pas l'approche du "on sait pas ce que c'est mais c'est pas grâve ca se verra pas" , je tente autre chose pour essayer d'éliminer ce problème. Maintenant c'est sûr que si je vois que ça me prend trop de temps j'abandonnerai....

Vinc

[invite84b0382c]

Re,

Il est clair que le "ah ca ? c'est pas grave, on coupera au montage" fait foi dans pas mal de labo, y compris le mien ... Je fais pas mal de microscopie en épifluorescence et de temps en temps je vois certaines cellules aspécifiques (a certains stades de mon protocole seulement ...) et mon responsable préfère zapper ca plutot que de s'y pencher justement ^^

Après, je suis d'accord sur le fait qu'on ne peut pas tout prendre en compte mais bon ... c'est blazant parfois

Tiens moi au courant pour ton problème. Ca m'intéresse même si je suis seul a avoir pris cas de ton pti problème de manip'

Akïn

[inviteffc67642]

Coucou

Moi aussi je suis intéressée, même si je n'ai rien de génial comme conseil à donner (j'aurais moi aussi tenté la BSA ou le lait, donc rien de bien nouveau), z'êtes pas tous seuls...

[invitec9f0f895]

salut

t'es sur que ta protéine P ne possede pas 6 his dans sa sequence
c'est con mais ca arrive frequemment

Yoyo

[invite654345]

Hello

Durant mon mémoire, j'ai du faire beaucoup de mise au point de mes WB, un des anticorps primaire donnait des bruits de fond terrible, Je suis arrivée à des résultats incroyable en enlevant la BSA d'un part et en la remplacant dans les différentes solution le lait "gloria" par le "lait amersham".
Sans vouloir faire de pub....
Dans le kit "ECL advance, il ya une poudre fournie que bien des labos mettent de côté en se disant "bah on a le gloria"

J'ai pu passer ainsi de dilution de 1/5.000 pour le primaire à 1/13.000 et de 1/100.000 pour le secondaire à 1/250.000 !!

Enfin j'espère que ca pourra t'aider

Bonne journée

[invite654345]

j'oublie de préciser, le gloria était à du 5%, et avec le lait amersham j'ai utilisé du 2 %..

voilà ciao ciao

[invitea0443c8c]

salut

t'es sur que ta protéine P ne possede pas 6 his dans sa sequence
c'est con mais ca arrive frequemment

Yoyo

oui j'ai vérifié

Merci Fatcha mais là je ne pense pas que ce soit un problème d'anticorps. L'anticorps que j'utilise est super bon et on a tous cette bande (je travaille avec 2 autres personnes sur la même thématique). Pour les western par contre j'utilise du lait Marvel! C'est vachement bien mais on ne le trouve qu'en Angleterre donc pas super pratique!


Je suis en train d'hybrider avec le primaire, résultats vers 16h...

[invitec9f0f895]

Si c'est vraiment une liaison aspecifique a ta colone, ta seule solution est d'augmenter la concentration saline de tes tampons pour diminuer cette interaction.
Maintenant je suis assez d'accord avec les gens de ton labo, si tu as l'interaction que tu veux voir, ca sert pas a grand chose de perdre du temps a essayer de te debarasser d'une bande qui ne te gene pas

Yoyo

[invitea0443c8c]

Ben si... conceptuellement ça me gène! Tu obtients la protéine qui n'a pas la modification que tu étudies en utilisant un système qui normallement ne doit sélectionner que les protéines portant cette modification....donc tu es en droit de te poser des quetsions sur le reste... surtout qu'il y a eu énormément de problème d epurif et que ça ne fonctionne que depuis peu de temps.
Pour les tampons, on en utilise 2 avec pour un du béta mercapto et pour l'autre de l'imidazole (entre autre)....ça doit quand même bien décaper et l'imidazole est sensé diminuer l'aspécificité....
Et en modifiant la concentration saline, ne risque t-on pas de diminuer également l'affinité de la colone pour les histidines?

A+
Vinc

[invitea0443c8c]

Salut!
Bon alors ......mes nitros sont complètement pouraves, j'ai eu pas mal de problèmes de gels etc....
Mais sur la manip qui nous interesse ici (enfin qui m'interesse moi en tout cas ), j'ai quand même bien l'impression que j'ai carrément diminué mon aspécificité, voire même presque annulé. Mais bon attention c'était un premier essais et il faut que je recommence. M'enfin disons que pour un premier jet la BSA 1% pendant 30 minutes, est plutôt positive....

Vinc

[invite4ff72fd5]

Salut , donc apparement en suivant sans intervenir (n'étant pas encore familier avec les protocols) ce serai un probleme de liaison aspécifique entre ta protéine et ta colonne que tu as globalement réglé en saturant à la BSA .

Si tu sature à la BSA tout en augmentant légérement la salinité de ton tampon n'obtiendrai tu pas de meilleurs résultats?
L'affinité de ta protéine His-Taggué est plus forte que celle de ta protéine liée de façon aspécifique donc en augmentant la salinité tu devrai quand même garder une bonne purif non ?