Dégradation des ARNs DNAsés ?

[fxmulder]

Salut,

J'ai un petit soucis avec mes manips en ce moment. En vue de quantifier des ARNm spécifiques, une extraction d'ARN au trizol à été effectuée, puis Dnase des RNA (avec RQ1) et RT avec oligo dT, puis finalement PCR radioactive. Le problème, c'est que les témoins pour la PCR ont marché, mais aucun de mes ARN n'a été amplifiés. En faisant migrer sur gel d'agarose 1%, on a noté que les ARN DNAsés étaient complètement dégradés alors que les ARN non DNAsés étaient non dégradés. Le truc, c'est que j'ai congelé à -20°C overnight les ARN DNAsés et fait la RT le lendemain matin.

Avez vous une idée sur ce problème, à savoir la dégradation de ces ARNm DNAsés ? Serait-ce dû à la congélation/décongélation ? Une contamination de la RQ1 par une RNAse ?

Avez vous une alternative ?

Merci beaucoup !!
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[invite84b0382c]

Salut,

J'ai un petit soucis avec mes manips en ce moment. En vue de quantifier des ARNm spécifiques, une extraction d'ARN au trizol à été effectuée, puis Dnase des RNA (avec RQ1) et RT avec oligo dT, puis finalement PCR radioactive. Le problème, c'est que les témoins pour la PCR ont marché, mais aucun de mes ARN n'a été amplifiés. En faisant migrer sur gel d'agarose 1%, on a noté que les ARN DNAsés étaient complètement dégradés alors que les ARN non DNAsés étaient non dégradés. Le truc, c'est que j'ai congelé à -20°C overnight les ARN DNAsés et fait la RT le lendemain matin.

Avez vous une idée sur ce problème, à savoir la dégradation de ces ARNm DNAsés ? Serait-ce dû à la congélation/décongélation ? Une contamination de la RQ1 par une RNAse ?

Avez vous une alternative ?

Merci beaucoup !!

Salut,

Plusieurs possibilités (comme d'habitude quoi )
Les ARN étant très peu stables, as tu pensé à bien les garder en glace chaque fois que c'était possible ?
Autre possibilité même si je n'y crois pas trop: quels sont les cycles de température que tu as utilisé pour ta RT ? Peut etre as tu utilisé une température trop haute qui a fini par dégradé tes ARN ?

Sinon, ce que tu peux éventuellement faire, c'est un dosage de ta quantité d'ARN après extraction histoire de voir un peu la différence. Deja, tu devrais pouvoir voir si le problème vient d'ici.

Est il possible pour toi de faire une extraction de tes ARN via un kit Qiagen ? Il n'utilise pas le Trizol et est peut etre moins dégradant. Pour info, je fais mes extractions en kit Qiagen et je passe par l'étape facultative de DNaseI. Je n'ai jamais eu de problèmes personnellement.

Tiens nous au courant

Akïn

[fxmulder]

Salut, et merci pour ta réponse !

J'ai en effet bien fait gaffe à tout faire dans la glace au maximum, donc je ne pense pas que ce soit dû à ça.

Pour la RT, j'ai mis tous les produits nécessaires, plus ARN et incubation 15min à température ambiante, puis 50min à 45°C et enfin 10min à 55°C. Et c'est en accord avec les recommandations du constructeur.

Je suis en train de retenter la manip avec des ARN non DNAsés... La RT est en cours... Résultats ce soir

Merci de ton aide.

FX

[Yoyo]

Je suis en train de retenter la manip avec des ARN non DNAsés... La RT est en cours... Résultats ce soir

Si tu n'es pas de part et d'autre d'un intron tu ne pourras pas savoir si ton ampli proviens d'une contamination par de l'ADN ou de ta RT...

pour ton probleme de degradation, le plus simple est d'imaginer en effet que tu as une RNAse qui traine quelquepart... l'enzyme est une bonne source de contamination.
yoyo

[A voir en vidéo sur Futura]