Différence de fixation des cellules

[invitecad90318]

Bonjour à tous,

J'ai fait un TP pour étudier l'impact de la MAP2c (microtubule assiciated protein) sur de cellules BHK (par transfection) et ce, afin d'extrapoler son rôle dans les cellules nerveuses, là où elle est naturellement exprimée.

Au cours du protocole, on a transfecté un vecteur codant pour GFP-MAP2c. Pour la préparation des lames, on a utilisé deux modes de fixation, un à l'éthanol, et l'autre au PFA. Lors de l'observation au microscope à fluorescence, on ne visualise pas du tout la même chose :
Pour et-OH : on visualise des filaments épais qui traversent plus ou moins la cellule
Pour le PFA tout le cytoplasme de la cellule semble être fluo. de façon hétérogène.

À priori, la bonne fixation est celle à l'et-OH puisque la MAP2c "linéarise" les microtubules, utile dans les axones des cellules neuronales, puisque cela permet de faire de véritables rails dans ces prolongements de sorte d'acheminer différentes molécules et autres protéines du corps cellulaire à la terminaison nerveuse.

Bref, tout ca pour vous demandez si vous savez pourquoi on observe une telle différence entre les deux fixations, pouvant expliquer ce que j'ai pu observer. Je sais que le PFA crée des liaisons covalentes entre les cellules, et que l'ethanol aura plutôt tendance à coaguler par deshydration les protéines, mais je sais pas pour autant expliquer ce résultat...

Merci pour vos réponses
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[invitea0443c8c]

Salut!
Bien souvent les différences de résultats entre les modes de fixation dépendent de l'anticorps utilisé et de la protéine visualisée. Certains Ab ne donnent aucun résultat en méthanol et s'utilisent exclusivement en PAF alors que pour d'autres c'est l'inverse! Et c'est un peu la même chose pour la perméabilisation. Donc je suppose que cela dépend de la structure et de la séquence de l'Ab et de la manière dont il réagit avec le fixateur. Pour la localisation des protéines c'est pareil, on peut voir des localisations différentielles selon le fixateur.
D'où l'importance de la mise au point en fonction de ce que l'on veut voir...


A+
Vinc

[inviteb73ce398]

Avec le methanol, la fixation s'effectue par deshydradation (denaturation des proteines) alors qu'avec les aldehydes (formaldehyde, glutaraldehyde) on conserve la structure 3D de la proteine (fixation par pontage). Donc effectivement, si tu utilises un anticorps conformationnel, la detection de ton antigene sera impossible apres une fixation en methanol. De plus, le methanol "decape" plus les structures si bien que certains antigenes inaccessibles pourront le devenir.

D'où l'importance de la mise au point en fonction de ce que l'on veut voir...

Ca me parait dangereux de formuler cela comme ca. Si on ne voit pas la meme chose entre deux modes de fixation, il convient de reflechir a des methodes pour confirmer ou infirmer l'une ou l'autre des observations. C'est d'ailleurs l'ecueil essentiel de l'immunofluorescence.

[invitea0443c8c]

Ca me parait dangereux de formuler cela comme ca. Si on ne voit pas la meme chose entre deux modes de fixation, il convient de reflechir a des methodes pour confirmer ou infirmer l'une ou l'autre des observations. C'est d'ailleurs l'ecueil essentiel de l'immunofluorescence.

Ben je ne sais pas ça dépend de ce que tu observes! Si tu sais que ta protéine est présente à deux endroits différents mais que tu ne peux pas voir les 2 localisations ensemble à cause de la fixation je ne trouve pas ça abérant.....

Vinc

[A voir en vidéo sur Futura]

[piwi]

Faut un peu se méfier de tout ce qui est immuno. Le résultat dépend grandement de la conformation de la protéine au moment où vous faites votre manip. En principe, les anticorps sont testés en western blot. Si il n'y a qu'une bande et de la taille attendue, c'est jugé comme bon et l'anticorps est déclaré spécifique. Il n'y a pour ainsi dire jamais de controle en cytoimmuno ou en histoimmuno. Du coup, avec un anticorps commercial vous n'êtes jamais vraiment certain que votre manip va bien fonctionner comme vous le voudriez. C'est un premier point.

Le second point est que quand bien même vous auriez un résultat en histo ou en cyto, il n'est pas simple d'avoir un vrai contrôle! C'est bien beau d'avoir une jolie colo dans la bonne cellule. Mais est ce votre protéine? Le vrai controle serait d'avoir une cellule mutante qui n'exprime pas la protéine du tout. Tout le reste laisse un doute. Evidemment ca n'est pas toujours possible.
Dans mon labo nous avons la chance d'avoir pas mal de mutants qui nous servent de controle dans la détection de ce que l'on recherche. Je peux vous assurer qu'avoir un bon anticorps spécifique est bien plus difficile que l'on peut le penser, il y a énormément de faux positifs. Donc méfiance avec l'immuno.

[invitea0443c8c]

Faut un peu se méfier de tout ce qui est immuno. Le résultat dépend grandement de la conformation de la protéine au moment où vous faites votre manip. En principe, les anticorps sont testés en western blot. Si il n'y a qu'une bande et de la taille attendue, c'est jugé comme bon et l'anticorps est déclaré spécifique. Il n'y a pour ainsi dire jamais de controle en cytoimmuno ou en histoimmuno. Du coup, avec un anticorps commercial vous n'êtes jamais vraiment certain que votre manip va bien fonctionner comme vous le voudriez. C'est un premier point.

Non là je ne suis pas tout à fait d'accord! La plupart des anticorps sont destinés et testé pour un usage particulier! Rien que chez Cell Signaling pour ne pas la citer, les anticorps sont validés pour une ou plusieurs manipe définit (western, If, immunohistochimie, immunoprécipitation, ...) et certains fonctionnent pour plusieurs d'entre elles! L'anticorps que j'utilise en routine fonctionne aussi bien en western qu'en IF....

Le second point est que quand bien même vous auriez un résultat en histo ou en cyto, il n'est pas simple d'avoir un vrai contrôle! C'est bien beau d'avoir une jolie colo dans la bonne cellule. Mais est ce votre protéine? Le vrai controle serait d'avoir une cellule mutante qui n'exprime pas la protéine du tout. Tout le reste laisse un doute. Evidemment ca n'est pas toujours possible.
Dans mon labo nous avons la chance d'avoir pas mal de mutants qui nous servent de controle dans la détection de ce que l'on recherche. Je peux vous assurer qu'avoir un bon anticorps spécifique est bien plus difficile que l'on peut le penser, il y a énormément de faux positifs. Donc méfiance avec l'immuno..

Certes mais là ce n'est pas spécialement une question d'anticorps! Que l'Ab soit spé ou pas il faut des contrôles qui bétonnent complètement la manip... On peut utiliser des mutants, des siRNA, des fusions, plusieurs types de microscoppie, etc....

A+
Vinc