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ubiquitine et protéasome



  1. #1
    delstephie

    ubiquitine et protéasome


    ------

    Bonjour a tous,

    je souhaiterai savoir comment je peux démontrer la dégradation d'une protéine par le système ubiquitine protéasome ?

    Le protéasome se situe au niveau cytosolique non ? Si ma protéine X d'intéret s'exprime au niveau nucléaire, et si je surexprime la protéine Y permettant d'apporter X à la voie de dégradation; est ce que je peux par un marquage spé de la protéine X montré sa dégradation? par exemple si le marquage de X se déplace du compartiement nucléaire vers cytosol ?

    Merci

    -----

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  3. #2
    Znomjo

    Re : ubiquitine et protéasome

    Pourquoi ne pas simplement marquer le protéasome et la protéine qui va être dégradée pas 2 fluorofores de couleurs différentes. Une juxtaposition des deux marquages pourrait révéler le même compartiment: le protéasome. Je ne sais pas si c'est vraiment réalisable ni si ça suffit pour montrer ce que tu veux mais c'est une idée!

  4. #3
    Yoyo

    Re : ubiquitine et protéasome

    Salut

    autant que je sache Il y aurait un proteasome dans le noyau.
    Pour tester il faut deja savoir si ta proteine est ubiquitinylée, ensuite il existe des mutants du proteasome et tu peux regarder si ta proteine est stabilisée dans ces mutants.

    Yoyo

  5. #4
    delstephie

    Re : ubiquitine et protéasome

    Comment savoir si ma protéine est ubiquitinylée ? y a une manip facile?

  6. #5
    Znomjo

    Re : ubiquitine et protéasome

    Mais si il existe un protéasome dans le noyau, comment pourras-tu voir que ta protéine est accumulée dans le protéasome (en utilisant un mutant du protéasome)? Tu crois qu'on peut le distinguer grâce à une différence de concentration?

  7. A voir en vidéo sur Futura
  8. #6
    Znomjo

    Re : ubiquitine et protéasome

    L'ubiquitination se fait essentiellement par phosphorylation il me semble, ajouter du phosphate radioactif permet peut-être de le voir (mais le phosphate est très utilisé dans la cellule ça risque de marquer tout et n'importe quoi...)

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  10. #7
    delstephie

    Re : ubiquitine et protéasome

    Non si il existe un protéasome dans le noyau je ne peux pas faire ce que je pensais

  11. #8
    Yoyo

    Re : ubiquitine et protéasome

    salut

    je confirme que le proteasome est nucleaire.
    http://cat.inist.fr/?aModele=afficheN&cpsidt=5282781
    http://www.pnas.org/cgi/content/full/96/11/6223
    http://www.signaling-gateway.org/upd...0/nrm1747.html

    Pour les mutants, il existe des mutations thermosensibles, donc a tp° permissive les proteines sont degradées, a tp° restrictive la proteine est stabilisée donc avec un puls chase on voi un temps de 1/2 vie plus important.

    Yoyo

  12. #9
    Znomjo

    Re : ubiquitine et protéasome

    En plus il est présent uniquement dans le noyau... Bah dis donc, je me coucherai moins bête ce soir.

  13. #10
    Toll

    Re : ubiquitine et protéasome

    bonjour,
    pour tester l'hypothese que ta proteine d'interet est degradee par le proteasome, avant de se lancer dans la microscopie confocale ou manip de co-IP prot / ubiquitin qui necessitent de la mise au point, inhibe le proteasome par des inhibiteurs (ex: MG-132, ALLN,...) (manip qui marche bien et qui est simple).

    si apres inhibition du proteasome, le niveau d'expression cellulaire de ta proteine est plus grand, tu pourras passer a l'etape suivant (ubiquitinylee? où? comment?)

    toll

  14. #11
    Znomjo

    Re : ubiquitine et protéasome

    Comment s'appelle la protéine responsable de l'ubiquitination?? Elle a un nom particulier? Je ne me rappelle plus...

  15. #12
    delstephie

    Re : ubiquitine et protéasome

    Citation Envoyé par Toll Voir le message
    bonjour,
    pour tester l'hypothese que ta proteine d'interet est degradee par le proteasome, avant de se lancer dans la microscopie confocale ou manip de co-IP prot / ubiquitin qui necessitent de la mise au point, inhibe le proteasome par des inhibiteurs (ex: MG-132, ALLN,...) (manip qui marche bien et qui est simple).

    si apres inhibition du proteasome, le niveau d'expression cellulaire de ta proteine est plus grand, tu pourras passer a l'etape suivant (ubiquitinylee? où? comment?)

    toll
    Merci pour les info sur les inhibiteurs.

    Je t explique la manip: Enfait je suis entrain de créer le vecteur de clonage permettant de surexprimer la protéine permettant de capter une autre pour l'envoyer au protéasome. Est ce que tes inhibiteurs peuvent s utiliser sur des cellules S2+ ? Est ce que tu penses que si je transfecte ce vecteur dans ces cellules en presence d'inhibiteur et que je marque ma prot soit disant dégradée je pourrais par cette methode confirmer ou pas sa dégradation ?

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  17. #13
    Vinc

    Re : ubiquitine et protéasome

    Salut!
    Citation Envoyé par delstephie Voir le message
    je souhaiterai savoir comment je peux démontrer la dégradation d'une protéine par le système ubiquitine protéasome ?
    Tu mets un bloqueur du protéasome comme le mg132 et tu regardes l'accumulation de ta protéine par western blot.


    Citation Envoyé par delstephie Voir le message
    Le protéasome se situe au niveau cytosolique non ?
    Citation Envoyé par delstephie Voir le message
    En plus il est présent uniquement dans le noyau
    Non il y a un protéasome dans le noyau ET dans le cytoplasme.


    Citation Envoyé par delstephie
    L'ubiquitination se fait essentiellement par phosphorylation il me semble, ajouter du phosphate radioactif permet peut-être de le voir (mais le phosphate est très utilisé dans la cellule ça risque de marquer tout et n'importe quoi...)
    Non ça dépend, il n'y a pas forcément phosphorylation avant ubiquitination, ce n'est pas le cas général (c'est en particulier valable pour la béta caténine et d'autres...).


    Citation Envoyé par delstephie
    Comment savoir si ma protéine est ubiquitinylée ? y a une manip facile?
    Montrer l'ubiquitination d'une protéine n'est pas une manip spécialement simple mais ce n'est pas impossible.
    Personellement j'utilise un système de purification sur Nickel. Je transfecte les cellules avec l'ubiquitine taggée (car voir une ubiquitination sans transfecter l'Ubi est impossible pour la plupart des protéines). Si la protéine est connue pour être dégradée par le protéasome, il faut bien entendu ajouter un bloqueur pour la visualiser. On purifie les lysats cellulaires et on fait un western avec l'Ab correspondant à la protéine étudiée (ou contre le tag si la protéine est taggée).
    C'est une manip assez longue (5 bonnes sjournées voire plus), qui demande pas mal d'habitude et de méthode pour avoir un blot relativement propre à la fin. Il faut se placer dans des conditions particulièrement stringantes pour la purification et il y a vraiment moyen de galérer....
    Et la quantification des blots est souvent indispensable pour pouvoir conclure...


    Tu travailles sur l'ubiquitine? Sur le protéasome? Qu'est ce que tu veux montrer exactement???

    A+
    Vinc
    Primum non nocere.

  18. #14
    delstephie

    Re : ubiquitine et protéasome

    Citation Envoyé par delstephie Voir le message
    Merci pour les info sur les inhibiteurs.

    Je t explique la manip: Enfait je suis entrain de créer le vecteur de clonage permettant de surexprimer la protéine permettant de capter une autre pour l'envoyer au protéasome. Est ce que tes inhibiteurs peuvent s utiliser sur des cellules S2+ ? Est ce que tu penses que si je transfecte ce vecteur dans ces cellules en presence d'inhibiteur et que je marque ma prot soit disant dégradée je pourrais par cette methode confirmer ou pas sa dégradation ?
    Et pour voir si la prot est ubitinylée je suppose qu il y a des encore anti-ubiquitine ?

  19. #15
    delstephie

    Re : ubiquitine et protéasome

    Citation Envoyé par Vinc Voir le message
    Salut!

    Tu mets un bloqueur du protéasome comme le mg132 et tu regardes l'accumulation de ta protéine par western blot.








    Non il y a un protéasome dans le noyau ET dans le cytoplasme.



    Non ça dépend, il n'y a pas forcément phosphorylation avant ubiquitination, ce n'est pas le cas général (c'est en particulier valable pour la béta caténine et d'autres...).



    Montrer l'ubiquitination d'une protéine n'est pas une manip spécialement simple mais ce n'est pas impossible.
    Personellement j'utilise un système de purification sur Nickel. Je transfecte les cellules avec l'ubiquitine taggée (car voir une ubiquitination sans transfecter l'Ubi est impossible pour la plupart des protéines). Si la protéine est connue pour être dégradée par le protéasome, il faut bien entendu ajouter un bloqueur pour la visualiser. On purifie les lysats cellulaires et on fait un western avec l'Ab correspondant à la protéine étudiée (ou contre le tag si la protéine est taggée).
    C'est une manip assez longue (5 bonnes sjournées voire plus), qui demande pas mal d'habitude et de méthode pour avoir un blot relativement propre à la fin. Il faut se placer dans des conditions particulièrement stringantes pour la purification et il y a vraiment moyen de galérer....
    Et la quantification des blots est souvent indispensable pour pouvoir conclure...


    Tu travailles sur l'ubiquitine? Sur le protéasome? Qu'est ce que tu veux montrer exactement???

    A+
    Vinc

    Enfait on s'intéresse à une protéine et apparement elle serait dégradée par cette voie mais rien ne l affirme. Pour etre amené au protéasome elle aurait besoin d'une protéine particuliere. Or cette proteine particuliere je suis entrain de la cloner afin de la surexprimer dans un modele. Et ce qui m interesse s'est de savoir s'il y a vraiment interaction entre ces deux proteines et donc si elle est degradé par la voie ubiquitine...

    Je ne suis peut etre pas assez claire

  20. #16
    Vinc

    Re : ubiquitine et protéasome

    Citation Envoyé par delstephie Voir le message
    Je t explique la manip: Enfait je suis entrain de créer le vecteur de clonage permettant de surexprimer la protéine permettant de capter une autre pour l'envoyer au protéasome. Est ce que tes inhibiteurs peuvent s utiliser sur des cellules S2+ ? ?
    A ma connaissance le mg132 s'utilise sur toutes les cellules...

    Citation Envoyé par delstephie Voir le message
    Est ce que tu penses que si je transfecte ce vecteur dans ces cellules en presence d'inhibiteur et que je marque ma prot soit disant dégradée je pourrais par cette methode confirmer ou pas sa dégradation ?
    Quelle ets la protéine que tu transfectes? c'est une E3 ou une autre protéine qui permet l'envoit de la protéine cible vers le protéasome??
    Si tu mets un bloqueur il n'y aura pas dégradation! Si tu vois une accumulation avec ton vecteur et sans ton vecteur (toujours avec un bloqueur) c'est que ton vecteur ne joue pas de rôle dans la dégradation. Si tu veux voir l'ubiquitination de la protéine alor sil faut bloquer le protéasome, et tu peux utiliser la technique classique de purif (mais qui est pas évidente du tout et demande un paquet d emise au point)...

    Vinc
    Primum non nocere.

  21. #17
    Vinc

    Re : ubiquitine et protéasome

    Citation Envoyé par delstephie Voir le message
    Et pour voir si la prot est ubitinylée je suppose qu il y a des encore anti-ubiquitine ?
    Ca ne te donnera pas d'info car il y a un très grand nombre d eprotéines ubiquitinées : ce n'est pas spécifique de la protéine que tu étudies !

    Vinc
    Primum non nocere.

  22. #18
    Znomjo

    Re : ubiquitine et protéasome

    Serait-ce possible de faire un mutant pour la protéine dont tu cherches le rôle??

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  24. #19
    delstephie

    Re : ubiquitine et protéasome

    Citation Envoyé par Vinc Voir le message
    A ma connaissance le mg132 s'utilise sur toutes les cellules...


    Quelle ets la protéine que tu transfectes? c'est une E3 ou une autre protéine qui permet l'envoit de la protéine cible vers le protéasome??
    Si tu mets un bloqueur il n'y aura pas dégradation! Si tu vois une accumulation avec ton vecteur et sans ton vecteur (toujours avec un bloqueur) c'est que ton vecteur ne joue pas de rôle dans la dégradation. Si tu veux voir l'ubiquitination de la protéine alor sil faut bloquer le protéasome, et tu peux utiliser la technique classique de purif (mais qui est pas évidente du tout et demande un paquet d emise au point)...

    Vinc
    Ok donc je peux tenter de cotransfecter avec mon vecteur et voir ce que ca donne au niveau de l'expression de la protéine ..

  25. #20
    delstephie

    Re : ubiquitine et protéasome

    Citation Envoyé par delstephie Voir le message
    Ok donc je peux tenter de cotransfecter avec mon vecteur et voir ce que ca donne au niveau de l'expression de la protéine ..
    Attend je comprends pas.. Tu me dis que si je transfecte avec mon vecteur + inhibiteur du protéasome et que je vois une accumulation avec et vecteur c'est qu'il n y a pas de lien avec la dégradation. Mais pourtant avec ou sans mon vecteur j aurai une accumulation vu que le protéasome est bloqué ???

  26. #21
    Vinc

    Re : ubiquitine et protéasome

    Citation Envoyé par delstephie Voir le message
    Enfait on s'intéresse à une protéine et apparement elle serait dégradée par cette voie mais rien ne l affirme. Pour etre amené au protéasome elle aurait besoin d'une protéine particuliere. Or cette proteine particuliere je suis entrain de la cloner afin de la surexprimer dans un modele. Et ce qui m interesse s'est de savoir s'il y a vraiment interaction entre ces deux proteines et donc si elle est degradé par la voie ubiquitine...
    Tu poses deux questions différentes!
    1. Y'a t-il réellement dégradation de ta protéine par le protéasome.
    Pour répondre à cette question dans un premier temps, tu mets du mg132, tu regardes si il ya plus de protéine lorsque tu mets du mg132 par rapport à ton contrôle négatif où tu ne mets pas de mg132. Si ca ne fonctionne pas c'est qu'effectivement il faut que tu surexprimes ton autre protéine. A ce moment là pas de problème tu refais la manip en surexprimant (en prenant bien soin de mettre tous les contrôles nescessaires : sans Ubi, sans protéine accessoire, sans mg132, ....).

    2. Y'a t-il intéraction entre ta protéine d'intérêt et la protéine accessoire sois disant nescessaire pour la dégradation? Et si oui, est ce que cette intéraction est nescessaire et suffisante pour la dégardation de ta protéine d'intérêt?

    Là il faut que tu montres l'intéraction par CO-IP ou par double hybride (ou les 2 pour être sûr).
    Ensuite il faut que tu mettes en place un protocolle qui permette d emontrer que sans cette intéraction ta protéine cible n'ets pas dégrader. Pour ce faire tu vas utiliser des mutants , des siRNA, etc....

    Tout ça est assez compliqué pratiquement parlant et va demander beaucoup de temps, de pratique et de patience !

    Envois moi un MP si tu veux parler de l'ubiquitination, c'est mon sujet de recherche et on peut éventuellement s'entraider !

    A+
    Vinc
    Primum non nocere.

  27. #22
    delstephie

    Re : ubiquitine et protéasome

    Citation Envoyé par Vinc Voir le message
    Tu poses deux questions différentes!
    1. Y'a t-il réellement dégradation de ta protéine par le protéasome.
    Pour répondre à cette question dans un premier temps, tu mets du mg132, tu regardes si il ya plus de protéine lorsque tu mets du mg132 par rapport à ton contrôle négatif où tu ne mets pas de mg132. Si ca ne fonctionne pas c'est qu'effectivement il faut que tu surexprimes ton autre protéine. A ce moment là pas de problème tu refais la manip en surexprimant (en prenant bien soin de mettre tous les contrôles nescessaires : sans Ubi, sans protéine accessoire, sans mg132, ....).

    2. Y'a t-il intéraction entre ta protéine d'intérêt et la protéine accessoire sois disant nescessaire pour la dégradation? Et si oui, est ce que cette intéraction est nescessaire et suffisante pour la dégardation de ta protéine d'intérêt?

    Là il faut que tu montres l'intéraction par CO-IP ou par double hybride (ou les 2 pour être sûr).
    Ensuite il faut que tu mettes en place un protocolle qui permette d emontrer que sans cette intéraction ta protéine cible n'ets pas dégrader. Pour ce faire tu vas utiliser des mutants , des siRNA, etc....

    Tout ça est assez compliqué pratiquement parlant et va demander beaucoup de temps, de pratique et de patience !

    Envois moi un MP si tu veux parler de l'ubiquitination, c'est mon sujet de recherche et on peut éventuellement s'entraider !

    A+
    Vinc
    OK je comprends pour montrer l'interaction je pense a faire un pull down

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