Stratégies d'insertion de fusions de gènes

[inviteb1ba0069]

Bonjour du matin, chagrin,

Et noeud dans la tête:
On me demande quels sont les avantages/inconvénients des stratégies d'insertion de gènes: ciblée et aléatoire (par transposition). J'ai quelques idées intuitivement, mais je ne sais pas si elles sont exactes et surtout exhaustives... Les voici:

Insertion ciblée:
1.permet la disruption du gène endogène par recombinaison homologue. ex: fusion d'opéron gène x' - lacZ recombinant avec le gène x endogène: la souche sera X- et l'activité Béta-gal dépendra du niveau d'expression de x.
2. possibilité de tester si le gène disrupté est bien x en faisant de la complémentation par exemple
3. Inconvénient: suppose le maintien de l'insertion, donc l'application d'une pression de sélection et donc que la construction porte le gène de sélection en plus du gène rapporteur. Possible?

Insertion aléatoire:
1. permet l'insertion en grand nombre de copies
2. Inconvénient: on ne sait pas où la contruction s'intègre, elle peut donc être insérée au coeur d'une séquence essentielle à la régulation du gène d'intérêt et donc l'activité du gène rapporteur peut ne plus refléter strictement le niveau d'expression du gène d'intérêt
3. La séquence peut même s'intégrer dans un gène essentiel à la survie et l'inactiver
4. Je suppose qu'il faut aussi un gène de sélection + pression de sélection...
5. On part sans a priori, donc on peut pêcher un truc intéressant, justement en observant les différences d'activités entre les différents recombinants obtenus et en tirer des conclusions sur les sites d'insertion.

On me demande en plus "Comment obtenir une fusion fonctionnelle par insertion aléatoire? Fréquence d'obtention des fusions fonctionnelles?"
Ça doit avoir un rapport avec les avantages et inconvénients,...

Au secours, j'ai la tête toute emmêlée!
SVP, dîtes moi où je me plante, ce à quoi je n'ai pas pensé, etc...
Merci d'avance,

Cécilus

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"La lumière des étoiles tombe doucement comme une pluie. Elle ne fait pas de bruit, elle ne soulève pas de poussière, elle ne creuse aucun vent" J.M.G. Le Clézio, Désert
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[LXR]

Bonjour,

Je te conseille fortement de lire cette publie ici.

C'est surtout appliqué pour la génération de souris KO, mais c'est valable pour ton problème, à noter que la mutagénèse insertionnelle au hasard est le gene-trapping et dirigée c'est le gene-targeting mais tu dois le savoir .

Pour faire bref, l'inconvénient de la dirigée est surtout qu'il faut utiliser des régions homologues grandes de part et d'autre du rapporteur et/ou gène de sélection. Ils se servent donc des BAC ou alors de la stratégie MICER (dans la publie). Le gene-trapping est assez efficace c'est pour ça que c'est une méthode bien aimée, il y a d'ailleurs un consortium européen sur le gene-trapping (IGTC : International gene-trapping Consortium). Après ce n'est pas un problème, pour identifier la région de l'insertion après avoir cribler les phénotypes intéressant, on fait un 3'RACE ou un 5'RACE, et on sait là où c'est intégré.

Autre truc, le gene-trapping permet de muter des gènes silencieux, en tout cas les inactiver grace au poly(A)-trap, car dans le cas du gene-targeting, la recombinaison homologue se fait difficilement aux endroits où la chromatine est répressive, ou alors elle se fait partiellement.

Tu parlais du fait que lorsqu'un gène important est inactivé on a la mort de la cellule (plus ou moins ça). Dans ce cas on peut utiliser la mutagénèse conditionnelle et donc là c'est du dirigé. Maintenant, on utilise le plus souvent le système Cre-LoxP. On flanque un gène ou un exon de sites LoxP dans des cellules possédant la Cre recombinase sous contrôle d'un promoteur inductible. Ainsi on peut contrôler la mutation dans le temps et l'espace.

Bon j'ai essayé de faire court, mais si tu lis cette publie fort intéressante, tu seras une experte du domaine.

PS : Si tu n'as pas accés à cette publie par biblioinserm ou bibliovie, écrit moi un MP

Greg

[inviteb1ba0069]

Bonjour de l'après-midi, spaghetti,

D'abord merci pour toutes les infos, qui me servent quoiqu'il en soit!
Le truc, c'est que là, tu parles de mutagénèse insertionnelle, qui consiste, si je ne m'abuse à muter un gène, de façon ciblée ou aléatoire dans le but d'établir si il participe ou non à tel phénotype donné.
Moi, ici, je suis plutôt dans une démarche de fusion de gènes (fusion traductionnelle) ou d'opérons (fusions transcriptionnelle) entre gène d'intérêt et gène rapporteur, de façon à étudier le type de régulations transcriptionnelles et post-transcriptionnelles qui contrôlent son niveau d'expression, ce dans différentes conditions (ex: t°C ou contexte génétique de la souche transformée).
Aurais tu des infos là dessus?

Cécilus

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"Quel besoin y a-t-il que le pont soit plus large que la rivière? Le nécessaire est toujours la plus juste des concessions." W.Shakespeare, Beaucoup de bruit pour rien

[Yoyo]

salut

les reponses de LXR sont bonnes mais tres spécialisées a un type d'organisme, chez les levures par expl ca ne se passe pas du tout comme ca.
Une correction en passant, la RACE PCR ne permet pas de savoir ou est inséré le transgene, ca ne permet que d'identifier le start de transcription d'un gene. Quand on en a les moyens le plus simple pour savoir ou est inéré le gene est de faire de la PCR reverse.

pour repondre a ta question, je ne vois pas pourquoi tu parles de disruption, puisque l'on peut tres bien faire de l'integration ciblée sans disrupter un gene ou sans en alterer son fonctionnement. In fois l'insertion effectuée, celle-ci est stable il n'y a donc pas besoin de maintenir la pression de selection.

Le probleme principal de l'integration aleatoire tu l'as donné, l'insertion dans un gene essentiel, mais il y a aussi le cas inverse, l'insertion dans une region ou le gene ne sera jamais exprimé (repression transcriptionnelle liée a l'etat de la chromatine). Proche des telomeres par expl.

YOyo

[A voir en vidéo sur Futura]

[inviteb1ba0069]

Bonjour du soir, espoir,
Ben en fait, je parlais de disrupter la copie endogène du gène d'intérêt, pour que les facteurs de régulation ciblent notre construction et uniquement celle-ci (genre : pas de compétition?)... Ou bien la copie endogène du gène rapporteur afin d'être sûre que l'activité observée soit bien dûe à notre construction et pas à une activité native (ça c'est déjà un peu plus logique, non? bien qu'il soit bien sûr plus simple d'utiliser une souche déjà mutée sur le gène rapporteur...).
Pour que l'insertion soit stable, comment tu fais si tu ne maintiens pas la pression de sélection notamment dans le cas d'insertion via des transposases? J'arrive à comprendre qu'une insertion via un plasmide vecteur et recombinaison homologue reste stable, mais le propre de l'élément transposable n'est-il pas justement de transposer? La cellule a t-elle intérêt à maintenir une insertion qui ne lui apporte rien? (c'est un peu finaliste comme question, mais c'est vrai: une construction portant une fusion de gènes constitue plutôt un fardeau métabolique pour la cellule si elle ne porte pas de gène lui servant réellement à quelque chose...).
Et sais-tu "comment obtenir une fusion fonctionnelle dans le cas d'une insertion aléatoire et fréquence d'obtention"? En fait, je ne comprends pas très bien comment le site d'insertion peut altérer le fonctionnement de la construction! A part dans le cas de l'insertion dont tu parlais, mais je suis chez une bactérie, et donc pas de télomère! Au secours!!!!!!!

Merci d'avance,
Cécilus

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"le ciel écrit avec des lignes d'or, en caractère distincts, les évènements de nos vies" Calderon, La vie est un songe