isotype et cytometrie

[invitec45abc54]

Bonjour à tous,
je suis en these depuis peu, et je suis en train de planifier mes travaux. Je vais faire de la cytometrie de flux sur des cellules de rat.
ma question est simple : quel isotype choisir??
en effet, j'ai bien compris son rôle, mais j'ai un doute (qui va peut etre vous sembler ridicule, mais je n'ai jamais été formé sur cette manip...)

J'utilise par exemple un Ac de souris anti-CD31 de rat. Quel isotype de controle dois-ju utiliser? IgG de rat ou de souris??
Pourquoi?

Merci d'avance pour vos réponses.
Marc
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[invitec25c96a0]

Bonjour,

Il faut utiliser un isotype souris. l'isotype sert à "mesurer" le bruit de fond de l'anticorps, pour cela, il faut qu'il se rapproche le plus possible de votre Ac anti CD31. Par exemple si l'anti CD31 est une IgG1 alors l'isotype doit être un souris IgG1 également.

cordialement

[invitec45abc54]

Bonjour,

Il faut utiliser un isotype souris. l'isotype sert à "mesurer" le bruit de fond de l'anticorps, pour cela, il faut qu'il se rapproche le plus possible de votre Ac anti CD31. Par exemple si l'anti CD31 est une IgG1 alors l'isotype doit être un souris IgG1 également.

cordialement

ok,
donc au risque d'être lourd, derniere confirmation (il ne faut pas que je me plante alors autant etre sur...)
je veux mettre en evidence le CD31 sur des cellules de rats, et j'utilise pour ca un Ac anti-CD31 de rat qui a été produit chez la souris... (isotype IgG2a par exemple)
il me faut donc un isotype IgG2a de souris comme contrôle du bruit de fond?

merci beaucoup en tout cas...
cordialement

[invitec25c96a0]

Bonjour,

oui tout a fait. et j`irais plus loin, si c`est possible, acheter l`isotype chez le meme fournisseur que l`anti CD31.
par curiosite, votre anti CD31 est couple avec quel fluorocrome ?

cordialement

[A voir en vidéo sur Futura]

[invitec45abc54]

Bonjour,

oui tout a fait. et j`irais plus loin, si c`est possible, acheter l`isotype chez le meme fournisseur que l`anti CD31.
par curiosite, votre anti CD31 est couple avec quel fluorocrome ?

cordialement

ca y es, je commence à bien comprendre.
Et dans le cas d'un marquage avec un Ac primaire non marqué révélé par un Ac secondaire (toujours pour de la cytometrie de flux), dois-je (ou devrais-je) utiliser un second isotype?

Sinon j'utilise le FITC comme fluorochrome, ou l'Alexa 488 quand celui-ci existe couplé à mon Ac...
Le probleme c'est que certains Ac de rats sont rare à trouver, encore plus couplés à des fluorochromes....

[invitec25c96a0]

Bonjour,

Dans le cas d`un marquage en deux couches, les temoins sont les suivants.
1- le secondaire seul pour mesurer son bruit de fond.
2- l`isotype controle (IgG2a souris par exemple) + le secondaire.

Je crois qu`il ne faut pas trop focaliser sur les isotypes. Certaines personnes sont tres circonspects sur leur utilisation. j`essairais de vous retrouver cette discussion (en anglais) ecrite par M rodoerer.

cordialement

[invitec45abc54]

autre question : pour la cytometrie de flux, que je prenne un Ac poly ou monoclonal ca change quelque chose??
Merci

[invitec25c96a0]

Bonjour,

A mon avis pas grand chose. Toutefois, vous aurez peut etre des meilleurs resultats avec un monoclonal (moins de bruit de fond).

cordialement

[invitec45abc54]

merci pour vos réponses qui me sont d'une aide precieuse.
J'ai une fois de plus une question (ou 2 )à vous poser :

-Afin de mettre en évidence plusieurs Ag différents, je n'ai pas pu choisir des Ac avec les même isotypes : j'ai donc différents Ac isotypés IgG, IgG1, IgG2a (de même espèce). Par contre j'ai pu avoir un marquage au FITC pour tous mes Ac. Dois-je faire un seul contrôle isotypique négatif avec une IgG:FITC, ou un de chaque (IgG:FITC, IgG1:FITC et IgG2a:FITC)?

-De plus, pour un marquage en 2 couches, un Ac anti IgG (Ac secondaire marqué) reconnaitra-t-il de manière sûre une IgG2a ou une IgG1 de même espèce(Ac primaire non marqué)? (sachant que IgG1 et 2a sont des sous-classes des IgG...??)

Je vous remercie encore pour votre aide précieuse.
Respectueusement,
Marc

[invitec25c96a0]

re,

Pour être rigoureux, il faudrait effectivement utiliser les isotypes corrects. Maintenant, de façon pratique, je suis pas sûre qu'il existe une différence significative entre une IgG1 et une IgG2a en terme de bruit de fond. Je ferais juste un témoin supplémentaire: les cellules seules sans aucun marquage pour voire si il existe du bruit de fond avec l'isotype contrôle.

un anti IgG doit reconnaitre toutes les IgG sauf si des spécificités sont notées sur la fiche technique.

Par contre le choix du FITC me parait pas le meilleur, en effet, c'est l'un des fluorochromes les moins sensibles en cytométrie. Généralement, on le réserve pour des antigènes fortement exprimés (ce qui est peur êrte votre cas).

Bonne chance pour votre manip


Cordialement

[invitec45abc54]

Je suis d'accord pour le FITC, mais malheureusement je n'ai pas trouvé d'Ac:Alexa pour les Ag que je veux mettre en évidence... En effet, les Ac anti-rats disponibles sur le marché ne sont pas très variés dès que l'ont cherche des Ag assez spécifiques et rares.
Mais de toute façon j'ai un protocole de culture cellulaire avant la cytometrie, et les marqueurs que je test doivent être expimés sur 100% des cellules, ou 0%.
Les marqueurs que j'utilisent sont discriminants absolu du type cellulaire que je cherche à mettre en évidence (en fait je cherche à valider un protocole de culture cellulaire...)
Devrais-je me méfier tout de même?
qu'en pensez-vous?

Bien à vous

Marc