identification d'un gène

[invite91dcd199]

Bonjour, j'aurais besoin de votre aide.
L'année dernière, en exam, une question nous a été posé et je n'ai pas pu y répondre et je n'y arrive toujours pas...
Enoncé: Dans le cas d'une maladie génétique, il ya plusieurs gènes dans une région d'un chromosome X. Certains codent des protéines dont la fonction est connue. En admettant que le syndrome observé est due à l'altération d'un seul gène, quelles stratégies expérimentales faut il utiliser pour identifier ce gène?

Je pense qu'un des stratégies est:
1) transfecter les banques d'ADNc dans un vecteur d'expression
2) détecter la protéine par des anticorps
3) séquencer protéine
Faire cela sur un patient sain et sur un patient malade et de voire les différences de séquences des différentes protéines et ainsi identifié le gène.
Ca serait possible?
Je ne voie pas d'autres manières...
Si vous arrivez à m'éclaircir cela.... Merci bcp d'avance!!
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[MaliciaR]

Bonjour, j'aurais besoin de votre aide.
L'année dernière, en exam, une question nous a été posé et je n'ai pas pu y répondre et je n'y arrive toujours pas...
Enoncé: Dans le cas d'une maladie génétique, il ya plusieurs gènes dans une région d'un chromosome X. Certains codent des protéines dont la fonction est connue. En admettant que le syndrome observé est due à l'altération d'un seul gène, quelles stratégies expérimentales faut il utiliser pour identifier ce gène?

Je pense qu'un des stratégies est:
1) transfecter les banques d'ADNc dans un vecteur d'expression
2) détecter la protéine par des anticorps
3) séquencer protéine
Faire cela sur un patient sain et sur un patient malade et de voire les différences de séquences des différentes protéines et ainsi identifié le gène.
Ca serait possible?
Je ne voie pas d'autres manières...
Si vous arrivez à m'éclaircir cela.... Merci bcp d'avance!!

Salut,
Sympa ta question
Mais j'en ai une, de mon côté. Lorsque tu parles de certains gènes codant pour des protéines dont la fonction est connue, est-ce que tu admets que celui que tu recherches en fait partie?
Si tu ne connais pas la protéine pour laquelle le gène code, comment sauras-tu avec quel anticorps la chercher?

Cordialement,


Est-ce que tu connais toutes les protéines codées par ces gènes?

[invite91dcd199]

Merci pour ta réponse!
Effectivement, le gène que je cherche fait partie des ces gènes dont on connait la fonction.
Pour ta deuxième question, je sais pas... l'énoncé que j'ai écrit est celui de la feuille d'exam donc... (désolée de pas en savoir plus).
Je suis un peu perdue dans toutes les stratégies expérimentales pour séquencer, identifier, ...
Je ne voie pas ce que le prof attendait de nous avec cette question? Il veux qu'on lui explique brièvement une ou plusieurs stratégies pour identifier ce gène parmis les autres.
Désolée de te donner que ces indications!
en tout cas merci!

[MaliciaR]

La stratégie que j'aurais proposé sans réfléchir trop, au pied levé quoi c'est de faire un vecteur avec le gène codant pour une protéine connue standardisée type GST (toute seule) et un autre vecteur avec un gène pour chacune des protéines susceptibles d'être en jeu fusionné avec le gène codant la GST : j'obtiendrai ainsi une protéine de fusion GST-X.
Ensuite, il me faudra faire exprimer ces deux vecteurs dans deux cultures bactériennes (ou de levure, en fonction du caractère plus ou moins "capricieux" des protéines eucaryotes), purifier ces protéines sur billes d'agarose couplées au glutathion et analyser ce qui sort. Puisque je connais leurs fonctions, je saurais (à peu près...) comment voir si une d'elles est là (si c'est une enzyme, faire des tests d'activité cinétique par exemple).
Ensuite, je devrai les chercher chez le sujet malade et chez le sujet sain.

Bon, si je raconte trop de bêtises, ne pas hésiter à me reprendre

Cordialement,

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite91dcd199]

Ah bien bien, le prof attendait peut être cette stratégie. Je m'attendais plus à utiliser une autre méthode tel que le clonage positionnel, gène candidat, clonage par expression, séquençage (vu en cours). Parce que ce que tu as décris, on ne l'a pas étudié en cours même si à mon niveau, j'devrais le savoir...
Mais ta réponse me plait... Merci

[MaliciaR]

Je ne sais pas quel est ton niveau d'études, je ne sais pas ce que vous avez vu en cours Je te dis ce qui me passe par la tête étant donné mes maigres connaissances en la matière...
Justement, ce qui serait cool c'est que tu lises bien ton cours et que tu présentes aussi une stratégie : on comparera les deux et on verra laquelle est la plus optimisée et la plus intéressante

Cordialement,

[MaliciaR]

Par ailleurs, voilà ce que j'ai trouvé sur le séquençage de protéines (méthode d'Edman généralement si je ne me trompe), la purif' est essentielle :

Limitations techniques
• Les peptides et les protéines dont l'extrémité N est bloquée (e.g. groupe amine avec un dérivé acétyl, formyl...) ne peuvent pas être séquencés.

• Les protéines de haut poids moléculaire (>75 kDa) se révèlent souvent difficiles à analyser. La raison en est, la plupart du temps, une quantité/qualité d'échantillon insuffisante. Pour ce type de protéine la purification, la séparation et le transfert doivent faire l'objet d'un soin particulier.

• Les acides aminés substitués ainsi que les Cys non modifiés donnent un cycle dit blanc (l'acide aminé est bien clivé de la chaîne mais n'est pas détecté).

• La qualité des échantillons est cruciale. Toute impureté pouvant intervenir dans les réactions chimiques en jeu (en particulier les espèces contenant un groupement amine) rendra l'analyse impraticable.

http://genosphere-biotech.fr/protseq/protseq.htm

Du coup, ça me paraît c***** (de toute façon, je n'aime pas le protéines!)

Cordialement,

[invite91dcd199]

Merci,
J'pense que le prof ne nous en demande pas autant (heureusement)!
Je vais encore essayer de réfléchir sur la question... et si je trouve un protocole pertinent, je te le présenterais...

[MaliciaR]

Tu dois forcément trouver un protocole avec tes connaissances, sinon on ne t'aurais pas posé la question...
Présente-le, c'est intéressant pour tout le monde, on est sur un forum => on échange des idées Et puis, personne n'a la science infuse donc si on se plante ce n'est pas la mort.

A bientôt!

[invite72953e70]

Bonjour !
Je suis passé par un labo de génétique humaine qui faisait des études type "gène candidat" dans le cas de maladies supposées mono-factorielle.
Ce sujet d'examen me rappelle fortement leur démarche.
On recherche (trouve) d'abord un locus lié génétiquement à la maladie (étude d'association). Dans le cas présenté, admettons qu'il existe sur le chromosome X une région candidate (qui segrège de façon particulière chez les malades). Bon, vu la resolution de ce type de méthode, tu as surement une dizaine (voir centaine) de gènes dans cette région candidate, c'est à dire susceptible de porter la mutation responsable du phénotype.
Avant de se jeter sur une étude fonctionnelle des différentes protéines codées par ces gènes, tu fait de la génétique !
L'approche dite de force brute, qui suppose un monde idéal rempli d'étudiant corvéables et de crédits : Tu séquences les parties codantes (exons) de tous les gènes chez tous les patients + quelques contrôles. sisi, ils le font vraiment ! Et la bingo, tu trouve une petite substitution non synonyme/indel dans l'exon lambda du gène tartampion chez tous les malades (et tu te jettes sur ton traitement de texte pour rédiger une publication).
Pour l'identification d'un gène causal, ca suffit !

Si le phénotype est cellulaire, il est de bon goût de vérifier que ton gène est "causal" en :
1) Le "déletant" (le mettre KO) dans une lignée cellulaire/modèle murin sauvage ( pas sur des embryons car c'est interdit ) pour vérifier l'apparition du phénotype "malade"
2) En complementant des cellules de malades avec une version "sauvage" du gène

Après tu peux commencer une étude fonctionnelle = tu sais que tel gène muté entraîne une maladie, mais pourquoi ?? Mais c'est une autre question, je crois. Et là effectivement tu va passer à la production d'anticorps à partir de ta protéine (soit fait maison, ce qui est pénible, soit en commandant l'anticorps idoine chez felix potin). Et en gros, tu caractérises ta mutation (probleme de repliment, localisation, modif post-traductionelle ou autre ...)

Un problème qui survient souvent, c'est que des mutations dans les parties non-codantes (introns, UTR, promoteur, enhancers) peuvent aussi empêcher l'expression correcte d'un gène ! Et là accroche toi pour le trouver/prouver.
Approche possible : Nothern blot / RT-PCR qui te permettent de vérifier l'absence/présence/quantité/taille anormale du messager (ARNm) chez tes malades.(pour les protocoles, voir livres/sites internet, toute façon je suis rouillé sur ma biomol).
En dernier recours, tu doit sûrement pouvoir faire de la protéine, c'est a dire des anticorps + bordelo-immuno-cyto-chimie, mais çà c'est vraiment pas ma tasse de thé.
Bon, j'ai pas la science infuse non plus, mais j'ai vu des gens bosser comme çà.
Hope this help
Etienne

[MaliciaR]

Ca a l'air pas mal ça, dis! Il est vrai que je n'ai jamais bossé sur des eucaryotes non plus
(C'est quand même génial les bactos, vu tout ce que tu décris ici...)

Cordialement,

[invite72953e70]

Alala, ne me fait pas envie avec tes bactos tranfectables avec un bon coup de jus !
Enfin les eucaryotes çà peut aller si on parle de droso ou de c elegans (qui a justement l'élégance de pouvoir être modifié génétiquement par ingestion de bacteries).
C'est l'homme qui est très peu "experimentable", et donc impropre à l'étude de la biologie.

[MaliciaR]

C'est ce que je me dis...
Mais ne me parle de C. elegans avec ces générations non coordonnées et sa bouffe affreuse! Tu passes plus de temps à essayer de synchroniser les bébêtes que maniper dessus...
Quand je dis que les bactos c'est génial, faut bien me croire Et puis, quand tu leur donne un peu trop de jus, le super arc électrique que ça fait...!

Par ailleurs, je voulais revenir sur la question de début. Si je connais la fonction des protéines qui seraient susceptibles d'être la cause de la maladie, comment je peux court-circuiter toute la stratégie que tu exposes ci-dessus?

Cordialement,

[invite72953e70]

court-circuiter des jours de paillasse ? mais pourquoi ?
En fait si les gènes candidats sont connus et annotés fonctionnellement, tu essayes d'être malin et d'infèrer, à partir de ce que tu sais de la maladie, la fonction moléculaire qui est susceptible d'être muté. C'est une histoire de flair !
si tu travaille sur un défaut immunitaire et que ta région contient une immunoglobuline, tu va commencer par te concentrer la dessus...
(bon des fois on a des surprises). Mais quoi qu'il en soit, si tu travailles sur une maladie génétique, tu ne peux pas t'affranchir de la recherche d'une mutation

[MaliciaR]

Non, pas court-circuiter des jours de paillasse...
Je voulais vérifier qu'il n'est pas recommandable de s'affranchir de la recherche d'une mutation, pour reprendre tes mots
Merci!
Cordialement,

[invite91dcd199]

Merci pour l'interêt que vous portez à ma question!
J'ai réflechi de mon coté, et j'ai pensé à plusieurs possibilités:
- on peut faire un clonage postionnel c'est à dire qu'on mappe génétiquement le chromosome par des techniques de cartographie (marqueurs) pour trouver l'endroit où est la mutation. Par exemple avec des marqueurs FISH.
- ou il faut d'abord regarder si les gènes sont exprimés dans les tissus par la maladie, par un run-on (sur noyaux isolés) pour voire le niveau d'expression selon les tissus d'un patient sain et d'un patient malade. Puis séquencer.
Donc voilà mes idées! Qu'en pensez vous?
Encore merci!

[invite72953e70]

Merci pour l'interêt que vous portez à ma question!
J'ai réflechi de mon coté, et j'ai pensé à plusieurs possibilités:
- on peut faire un clonage postionnel c'est à dire qu'on mappe génétiquement le chromosome par des techniques de cartographie (marqueurs) pour trouver l'endroit où est la mutation. Par exemple avec des marqueurs FISH.

D'après l'énoncé, tu connaît déjà la région du chromosome X qui porte ton gène d'intérêt. Le clonage positionnel est déjà fait, si l'on veut. Pour faire de la cartographie fine, il me semble que le FISH a une résolution un peu grossière (1MB dans mes souvenirs). Par contre c'est vrai que tu peux éventuellement détecter l'absence/présence/translocation du gène avec ta sonde, voir - mais là je spécule - une variation du nombre de copie (CNV, très à la mode).

- ou il faut d'abord regarder si les gènes sont exprimés dans les tissus par la maladie, par un run-on (sur noyaux isolés) pour voire le niveau d'expression selon les tissus d'un patient sain et d'un patient malade.

Oula. Du Run on ! j'ai jamais entendu parler de cette technique que dans mes cours de biomol. Et également par de vieux chercheurs nostalgiques (si je me trompe et quelqu'un utilise cette technique couramment je m'excuse).
Il me semble qu'on fait plutôt des RT-PCR (amplification spécifique de transcrit) voir des Q(pour quantitative)RT-PCR.
Quant à travailler sur des cellules uniques, c'est vraiment de la haute voltige réservé à l'étude de mécanisme très particulier (différentiation de type cellulaire par exemple).
Si les patients ont une maladie génétique (héritée), tu doit pouvoir retrouver la mutation partout

Puis séquencer.

enfin !

Donc voilà mes idées! Qu'en pensez vous?
Encore merci!

Hope this help
Etienne

ps une adresse :
http://www.inra.fr/internet/Produits.../hs20.htm#tab1
Mais ne perd pas de vue que pour l'homme, on possède une belle carte physique ! (séquence génomique)

[MaliciaR]

Bonjour,

Tu n'as toujours pas répondu à ma question, Nissabiol : tu es en quelle année d'études? Et en quelle fac?
Parce que je n'ai jamais entendu parler des choses que tu énonces (FISH, run-on,...) alors que Paris 6 n'est pas une fac trop mauvaise et on fait quand même pas mal de choses...
Cordialement,

[invite91dcd199]

Merci étienne pour tes remarques! En cours de génétique, on a surtout vu le Run-on et parlé très rapidement de la RT-PCR. Comment fait-on pour séquencer? (on n'en a pas parlé en cours) j'ai entendu parler de méthode Sanger mais ça m'a l'air assez compliqué..., il y a une autre méthode? (dis moi juste le nom, je chercherais le principe)
Pour répondre (enfin!) à ta question Malicia, je suis en 3ème année de licence de sciences de la vie à la fac de Nice.

[MaliciaR]

Cool, vous faites des choses sympa à Nice
Voilà, pour vanter ma fac , je te laisse un lien pour le séquençage :
http://www.snv.jussieu.fr/vie/dossie...e/sequence.htm
Assez succint, mais bien :
http://www.inapg.inra.fr/ens_rech/bi...sequencage.htm

Sinon, le site dont j'avais pris une citation dans un de mes précédents messages est assez bien pour le séquençage de protéines.

Cordialement,

[invite91dcd199]

Merci pour ces sites, ils ont l'air assez simples sachant que c'est seulement pour ma "culture générale"! (j'aime bien les petites animations!).
Bonne soirée

[invite3900018c]

Bonjour !
Je suis passé par un labo de génétique humaine qui faisait des études type "gène candidat" dans le cas de maladies supposées mono-factorielle.
Ce sujet d'examen me rappelle fortement leur démarche.
On recherche (trouve) d'abord un locus lié génétiquement à la maladie (étude d'association). Dans le cas présenté, admettons qu'il existe sur le chromosome X une région candidate (qui segrège de façon particulière chez les malades). Bon, vu la resolution de ce type de méthode, tu as surement une dizaine (voir centaine) de gènes dans cette région candidate, c'est à dire susceptible de porter la mutation responsable du phénotype.
Avant de se jeter sur une étude fonctionnelle des différentes protéines codées par ces gènes, tu fait de la génétique !
L'approche dite de force brute, qui suppose un monde idéal rempli d'étudiant corvéables et de crédits : Tu séquences les parties codantes (exons) de tous les gènes chez tous les patients + quelques contrôles. sisi, ils le font vraiment ! Et la bingo, tu trouve une petite substitution non synonyme/indel dans l'exon lambda du gène tartampion chez tous les malades (et tu te jettes sur ton traitement de texte pour rédiger une publication).
Pour l'identification d'un gène causal, ca suffit !

Si le phénotype est cellulaire, il est de bon goût de vérifier que ton gène est "causal" en :
1) Le "déletant" (le mettre KO) dans une lignée cellulaire/modèle murin sauvage ( pas sur des embryons car c'est interdit ) pour vérifier l'apparition du phénotype "malade"
2) En complementant des cellules de malades avec une version "sauvage" du gène

Après tu peux commencer une étude fonctionnelle = tu sais que tel gène muté entraîne une maladie, mais pourquoi ?? Mais c'est une autre question, je crois. Et là effectivement tu va passer à la production d'anticorps à partir de ta protéine (soit fait maison, ce qui est pénible, soit en commandant l'anticorps idoine chez felix potin). Et en gros, tu caractérises ta mutation (probleme de repliment, localisation, modif post-traductionelle ou autre ...)

Un problème qui survient souvent, c'est que des mutations dans les parties non-codantes (introns, UTR, promoteur, enhancers) peuvent aussi empêcher l'expression correcte d'un gène ! Et là accroche toi pour le trouver/prouver.
Approche possible : Nothern blot / RT-PCR qui te permettent de vérifier l'absence/présence/quantité/taille anormale du messager (ARNm) chez tes malades.(pour les protocoles, voir livres/sites internet, toute façon je suis rouillé sur ma biomol).
En dernier recours, tu doit sûrement pouvoir faire de la protéine, c'est a dire des anticorps + bordelo-immuno-cyto-chimie, mais çà c'est vraiment pas ma tasse de thé.
Bon, j'ai pas la science infuse non plus, mais j'ai vu des gens bosser comme çà.
Hope this help
Etienne

Merci pour ce résumé très intéressant des démarches possibles.
Mais ce sont vraiment des travaux pharaoniques.
J'ai des difficulté dans la pratique avec un sujet exactement semblable : un patient, un locus, des gènes candidats dont les fonctions sont connues ou pas connues. Mais pour séquencer tous les gènes, sur tous les patients, et même des régions promotrices, sans parler des effets de position (que la région régulatrice peut se trouver très loin), on s'en sort pas. En tout cas, je m'en sors pas.
Je vous raconte mes démarches :
- clonage positionnel (par FISH) pour identifier le locus de la maladie (ici, c'est la localisation des points de cassure d'une translocation).
- regarder dans la région des gènes annotés et pas encore annotés : fonctions, expression dans quels types de tissu, si par hasard nous trouvons des choses compatibles avec la maladie, c'est formidable.
- RT-PCR de tous ces gènes (même quantitative RT-PCR) : quel(s) gène(s) s'exprime chez les normaux et absent chez le malade : le(s) gène(s) candidat(s)
- séquencer ces gènes candidats pour chercher la mutation
voilà c'est déjà 4 ans de travail (je suis presque seul dans ce projet).
J'ai maintenant une difficulté, j'espère avoir vos conseils et réflexions :
Je tombe sur un nouveau gène : perte expression chez le patient, coupé en deux par le point de cassure. Mais : fonction complètement inconnue, même la structure intron, exon décrite est incomplète.
J'ai commencé à explorer la structure de ce gène par RACE-PCR, avancer vers les 2 extrémités pour rechercher des exons non décrit.
Je trouve effectivement des nouveaux exon, mais :
- le séquençage est bloqué par une région poly(T), je ne peux plus avancer
- le morceau d'exon avant le tract poly(T) est trop court : 13 bases, par BLAST je ne peux pas définir la position sur chromosome, donc je ne peux pas avancer "en aveugle" en sautant une petit région et séquenser dans le sens inverse.
Donc je suis complètement bloqué. Je souhaite savoir si quelqu'un a eu des problèmes semblables, comment on peut envisager de les surmonter!!!
Merci de m'apporter une aide avec vos cerveaux.
Je vous attends, le coeur battant...

[Yoyo]

Salut

Ta sequence polyT ne proviendrait-elle pas simplement de la reverse transcription de la queue polyA de l'ARNm?

YOyo

[invite3900018c]

Salut

Ta sequence polyT ne proviendrait-elle pas simplement de la reverse transcription de la queue polyA de l'ARNm?

YOyo

Non, car ici c'est le côté 5' du gène. Et même si le fournisseur a ajouté une queue poly A au 5' des gènes pour l'obtention de l'ADNc double brin, le séquençage doit voir directement un polỵA) tract, et non un poly(T) (j'ai fais un dessin pour vérifier.
Merci de m'avoir répondu. C'est bien de ne pas se sentir seul devant les problèmes.

[piwi]

Mais le polyT est dans un fragment PCR?
Vous ne pouvez pas essayer d'isoler le fragment qui pose une difficulté, le digérer par restriction, cloner et séquencer les inserts?
Si y a un problème avec le polyT vous ne pouvez pas amorcer avec un polyA?

Cordialement,
piwi

[invite3900018c]

En plus, j'ai oublié de préciser, la produit de PCR fait environ 1000 bases, et le séquençage est bloqué à la position 150. Je me demande si ça peut être expliqué par :
-l'ajout d'une queue poly(T), et non poly(A), à l'extrémité 5' de l'ARN par le fournisseur (je demande tout de suite à Clontech)
- le fait que le produit est long et la séquence est courte peut être expliqué par un mécanisme quelconque... (mais lequel? une polymérisation des fragments PCR? la bande de 1000 bases que je vois est non spécifique, et je séquence une autre bande 150 bases invisible sur gel )

[invite3900018c]

Mais le polyT est dans un fragment PCR?
Vous ne pouvez pas essayer d'isoler le fragment qui pose une difficulté, le digérer par restriction, cloner et séquencer les inserts?
Si y a un problème avec le polyT vous ne pouvez pas amorcer avec un polyA?

Cordialement,
piwi

Effectivement, la solution de cloner j'ai déjà pensé, mais le budget reste limitant et...
Mais l'idée d'utiliser une amorce poly(A) est vraiment superbe. Je vais l'utiliser en nested, pour éviter les morceaux 3' avec queue poly(A) qui n'ont rien à voir avec l'histoire.
Merci beaucoup.