expression spatiale et temporelle d'un gene???

[invite29ebacd5]

Bonjour, j'ai un essai à écrire dont l'énoncé est:
Vous avez juste cloné un gène qui est exprimé spécifiquement dans le tube neural de l'embryon de poulet. Quelles experiences feriez vous pour comprendre son role dans le "développement" du tube neural? Et comment déterminer si son role est conservé ou non chez d'autres espèces?
Je suis un peu perdue pour les première experiences à faire.
Dans un premier temps, je pense qu' il faut que j'analyse l'expression spatiale et temporelle du gène et je ne sais pas trop quelles techniques utiliser... Un système rapporteur? DNA microarrays?
Merci beaucoup si vous pouvez m'aider
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[piwi]

pour l'expression spatiale et temporelle il y a un système tres puissant chez la souris qui est la mutagénèse somatique dirigée par le système Cre/LoxP qui te donne une information spatiale et le système CreERt/LoxP qui peut te donner l'information temporelle.
Je ne t'en dis pas plus vu que c'est pour un devoir je te laisse chercher.

Maintenant on est chez le poulet et on ne peut pas y faire de la recombinaison homologue mais le poulet est aussi un modèle tres puissant. On peut y faire de l'electroporation facilement, des greffes.
Bonnes recherches mais avec un tout petit peu d'attention tu devrais pouvoir trouver tes reponses facilement.

[invite29ebacd5]

Merci beaucoup... En fait, dans une première partie, j'utilise les techniques de whole-mount in situ hybridization et in situ hybridization afin de déterminer l'expression spatiale et temporelle de mon gène. Je pense également utiliser la technique de DNA microarray afin de "placer mon gène dans un signaling pathway" mais je ne sais pas si c'est très pertinent???
Ensuite, j'utilise une approche de loss-of-function (in ovo RNA interference) et gain-of-function.
Est-ce que c'est ok?

[piwi]

si tu es chez le poulet ca me semble pas mal du tout oui.
l'interet de l'oeuf c'est que tu peux effectivement jouer dessus.
Il faut que tu parles d'elecroporations. L'idée est que l'on peut n'electroporer (avec un trangène) qu'un coté. C'est interessant parce que dans ces manip' tu as sur le même embryon ta manip' et son controle.
Ce qui est encore possible de faire chez le poulet c'est de placer d'un coté de petites billes enduite d'un produit de ton choix. Si le produit de ton gène est diffusible tu peux voir ce que ca fait de le surexprimer comme ca. Ca se fait tres courament.

voilà ca c'est deux grandes techniques classiques dans l'etude du developpement sur le modèle poulet.

Tu peux aussi suivre les lignages cellulaires en faisant des greffes poulet/caille. C'est les experiences classiques de LeDouarin sur les cretes neurales.

Je crois que l'on a fait le tour des techniques propres au poulet.


Pour le suivi spatio temporel chez le poulet il n'y a guère que l'hybridation in situ (qui suit les ARNs)
Elle doit toujours etre coulpée d'une etude immunomarquage par contre (enfin c'est mon avis)
Je m'explique: L'arn est assez instable et il se peut tres bien que tu perdes le signal à un moment quand le gène n'est plus exprimé. Est ce que cela veut dire que tout est fini? Non. La proteine peut etre stable et se maintenir bien plus longtemps.
Si tu veux quantifier l'expression de ton gène par contre tu ne pourras pas le faire avec l'hybridation in situ qui est purement qualitative (où ca s'exprime et quand) Tu peux associer des RT-PCR pour quantifier tes ARNs. Là tu as fais le tour de l'expression de tes ARNs.

Pour agir plus il faut changer de modèle et aller chez la souris. La tu peux inactiver le gène
KO de facon définitive
knock in: tu marques les cellules qui auraient du exprimer le gène. Partique pour voir ce qu'elles deviennent.
knock out somatique conditionnel par la technique creERt/Lox tu peux inactiver selectivement quand tu veux le gène dans le tissu que tu veux.
système promoteur du gène/Cre +RosaLacZ marquera les cellules mutées défintivement. pratique pour faire du lignage.

Si tu as des questions n'hésite pas mais prends quand même le temps de réfléchir ^_^

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite29ebacd5]

Merci beaucoup!
Mais que penses-tu du DNA microarray pour placer le produit de mon gène dans une cascade de signalisation? Comme c'est assez nouveau comme technique, je n'arrive pas à trouver des informations qui me satisfont...

[invite9e6bc039]

Ben c'est tres cher et ca sert a rien

[invite75b8241e]

Pourtant les chercheurs ont l air d être enthousiasmés par cette technique!! il semblerait qu effectivement comme le dit audichou que l on puisse "placer son gène dans un signaling pathway" entre autres ....

[piwi]

elle est tres peu utilisée dans le developpement en fait.
Mais dans l'absolu pourquoi pas?
Ceci dit c'est brutal, cher et peu élégant.
Il ets quand même rare que l'on trouve un gène totalement inconnu dans le developpement. Bien souvent il est homologue à un autre ou recelle quelques indices qui orientent vers une voie plutot qu'une autre.
Surtout que les voies de signalisation dans le developpement du tube neural ne sont pas quand même pas légion. sonic, bmp, wnt, un peu les acides retinoiques (mais ca semble secondaire ici)
Alors evidemment apres tu as les voies de differentiation et les gènes hox.
Enfin en un mot tu n'est pas obligé de partir à la peche au gros quand tu as 90% de chances voir plus de retomber sur ces voies là. Autant les tester d'abord puis ensuite si y a rien tu pourras toujours voir.

[invite9e6bc039]

Pourtant les chercheurs ont l air d être enthousiasmés par cette technique!! il semblerait qu effectivement comme le dit audichou que l on puisse "placer son gène dans un signaling pathway" entre autres ....

Je suis bien au courant

Mais c'est pas le Graal pour autant, et pour tout dire c'est meme relativement decevant, en comparaison de son prix. A la fin de la manip' tu te retrouves avec un millier de genes qui semblent etre genetiquement proches du tient, et c'est impossible a interpreter.

Mais je suis d'accord, c'est une technique interessante lorsqu'elle est bien "pensee".

[invite29ebacd5]

J'ai encore une question
Quand je fais mon in ovo RNA interference, j'injecte dans le tube neural mon ds RNA et ensuite j'effectue mon electroporation. Il faut également que je co-electropore un plasmide exprimant EGFP, par exemple, de façon à me rendre compte du rendement de ma transfection, non? Mais est-ce que mes deux transfections se font aussi bien l'une que l'autre?
Merci beaucoup...