Bloquer l'expression d'un gène chez la levure

[invite481f0dd7]

Salut
j aurais voulu savoir si il existait chez la levure un moyen de bloquer spécifiquement l expression d un gène chez la levure? mais de bloquer de façon temporaire donc pas de deletion; un peu comme les RNAi...
merci
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[inviteb7174662]

Salut,

Je pense que tu appliquer la méthode suivante :

Tu transfectes tes levures avec un plasmide portant la séquence de ton gène flanquée en amont par le promoteur inductif du gène lacz.
Il faut ensuite qu'il y ait recombinaison homologue de cette construction au locus de ton gène d'intéret.
(on contrôle que l'insertion a eu lieu au bon locus par PCR).

Ensuite tu as juste à mettre (ou non) de l'IPTG dans le milieu de culture pour contrôler l'activité transcriptionnelle de ton promoteur lacz.
(IPTG --> Transcription, pas d'IPTG --> Pas de transcription) ^^

Tu peux donc toi même choisir quand activer ou ne pas activer l'expression de ce gène ^^

[invitea0443c8c]

Salut!
Oui ça peut être une possibilité... Sinon tu peux aussi faire une banque de levures mutées par transposons et ensuite tu sélectionnes le gène spécifique.
Sinon y'a encore un truc qui me vient à l'esprit mais je ne suis pas certain que ce soit très rigoureux : tu n'inactive pas le gène endogène mais tu transfectes avec un plasmide surexprimant à fond le gène muté! La protéine mutée va rentrer en compétition avec la protéine sauvage et même si le gène sauvage est toujours actif tu va avoir de l'inhibition à cause de la grosse quantité de protéine mutée... Mais après ca dépend aussi du gène!

[invitea0443c8c]

Bon je viens de relire ton message initial et tout ce que j'ai dit ne marche pas parce que tu veux une inhibition qui soit réversible! Donc pour moi le mieux c'est le système Tet ON/ Tet OFF....Là ca sera réversible! Ou alors tu as le système Cre Lox mais tu peux l'utiliser qu'une seule fois car une fois que tu à mis ta recombinase c'est finit ton gène sera délété...

Vinc

[A voir en vidéo sur Futura]

[invitec9f0f895]

Salut

Vous vous compliquez bien la vie
Pour l'IPTG je ne suis pas certain qu'il fonctionne chez la levure... je rappelle a toute fin utile que c'est un promoteur bacterien! y'a peu de chance qu'il fonctionne dans la levure, surtout qu'il necessite la presence de la protéine LacI pour etre réprime!

Le RNAi ne marche pas chez la levure, alors coté systeme inductible il y a en effet le systeme TET qui active ou inavite le promoteur en présence de tetracycline, mais le systement le plus utilisé est le promoteur GAL, qui est fortement induit en presence de galactose et en absence de glucose. Alternativement il existe des promoteur type MET15 qui sont inductible en absence de methionine.

Yoyo

[invite481f0dd7]

ok merci!
le systeme gal est plutot pas mal d autant que je veux faire une cinétique a partir du moment ou la transcription est arretée et que d apres ce que j ai lu 4 minutes suffisent pour induire ou arreter la transcription

[invite35e155ed]

je veux induire l'expression de ma proteine chez la levure pichia normalement cette proteine doit etre excreté hors de la levure.j'ai fait un preculture dans le BMGY et apres dans le BMMH( 0.5% methanol) à 30°c.
j'ai utilisé 3 types de plasmides ppicz, ppiczalpha et pGap.
le probleme que j'ai un production de ma proteine mais elle reste toujours dans la levure et ne sorte jamais .c'est dans les tois types de plasmides.
j'ai pas une explication et meme pas une idée pour induire l'expression de ma proteine et la produie vers l'exterieu de la levure