Stabilisation d'un plasmide chez la levure

[invitede922c4c]

Bonjour,

je me permets de vous solliciter car je suis confronté à un petit problème concernant la stabilisation d'un plasmide chez la levure Saccharomyces cerevisiae.
J'ai reçu un mutant ne pouvant pas pousser en absence d'uracile (donc auxotrophe pour l'uracile)et possédant un plasmide permettant d'exprimer une protéine (Hsp104) dont le gène est sous la tutelle d'un promoteur induit par l'oestradiol. Ce plasmide contient le gène URA 3+ permettant la croissance en absence d'uracile.

Ainsi pour pouvoir stabiliser un plasmide au cours des générations il faudrait que je cultive mon mutant sur un milieu dépourvu d'uracile (pour le forcer à utiliser ce plasmide) hors c'est les vacances et mon directeur de labo n'est pas présent pour me signer un bon de commande pour ce type de milieu minimum.



Je souhaite savoir si il est possible de stabiliser le plasmide en cultivant le mutant sur un mileu riche (Malt Wickerham) et en présence d'ampicilline (en effet sur le plasmide est présent un gène de résistance à l'ampicilline). Je me permets de poser cette question puisque dans la bibliographie les levures ne sont pas sélectionnées via l'utilisation des gènes de résistance aux antibiotiques (contrairement à ce qu'il se fait chez les bactéries). Il semble que ces gènes de résistances soient insérés dans les plasmides qui sont préalablement multiplier chez une bactérie (Escherichia coli en général).
Je n'arrive pas à trouver d'infos sur les effets de l'ampicilline sur cette levure. Pouvez-vous m'indiquer le cas échéant à quelle concentration utiliser l'ampicilline (afin qu'elle tue la souche sauvage (control négatif) et pas le mutant)?

D'avance merci pour vos remarques.

PS : je ne sais pas si j'ai placé le sujet au bon endroit car il rélève aussi bien de la microbiologie que de la biologie moléculaire
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[invitec9f0f895]

Salut

Malheureusement pour toi l'ampicilline n'a aucun effet sur la levure. Tu ne pourras donc pas maintenir ton plasmide de cette maniere la.

Sinon tu as du milieu riche (YPD?) Tu tiens a garder ta souche ou c'est le plasmide qui t'interesse?
Autre question, tu l'as recu sous quelle forme? sur boite?
et enfin, dans combien de temps reviens ton directeur de labo?

YOyo

[invitede922c4c]

Salut

Malheureusement pour toi l'ampicilline n'a aucun effet sur la levure. Tu ne pourras donc pas maintenir ton plasmide de cette maniere la.

Sinon tu as du milieu riche (YPD?) Tu tiens a garder ta souche ou c'est le plasmide qui t'interesse?
Autre question, tu l'as recu sous quelle forme? sur boite?
et enfin, dans combien de temps reviens ton directeur de labo?

YOyo

Bonjour et merci pour votre réponse.
Pour répondre à vos question je n'ai pas de milieu YPD mais j'ai du MW. Ce qui m'intéresse c'est de conserver la souche mutée telle qu'elle est (avec son plasmide). J'ai reçu la souche sur un milieu gélosé. Je pourrai faire des bons de commande dans 1 semaine.

D'avance merci pour vos remarques

[invite8c0cc995]

Stockée à +4°C, ta souche tiendra le coup. Assure toi juste que ta boite ne seche pas en mettant du parafilm autour. Perso j'ai réussi à garder des levures comme ca pendant un moment. Au bout de 2 mois il commence à y avoir quelques problèmes pour les faire repartir, mais 7-15j à +4°C ne m'a jamais posé de problème.
Sinon si tu as vraiment peur, s'il te reste un peu de place sur ta boite, tu peux toujours re-strier une partie de la colonie sur la même boite.

Et puis juste en rappel, l'ampiciline est un antibio procaryote qui joue sur la membrane des bactéries, la levure est un eucaryote, qui n'a pas de membrane bactérienne.

[A voir en vidéo sur Futura]

[gorben]

Salut,

Sinon tu vas faire le forcing sur la secretaire/comptable pour qu'elle accepte le bon de commande sans signature... Je trouve ca fort que tu sois bloque comme ca juste pour cette raison ! Ca doit pas couter 2000E un flacon de ton milieu de culture.

A+

[invite17a570c1]

Hello,

Au pire, tu fais ton milieu tou(e) seul(e). Voici un petit protocole qui peut t'être utile :

YPD medium
20 g/L Difco peptone
10 g/L Yeast extract
20 g/L Agar (for plates only)
Add H2O to 950 ml. Adjust the pH to 6.5 if necessary, then autoclave. Allow medium to cool to ~ 55°C and then add dextrose (glucose) to 2% (50 ml of a sterile 40% stock solution). Adjust the final volume to 1 L if necessary.

Ca vient d'ici : http://www.bristol.ac.uk/biochemistry/stephens/ypd.pdf

Tu peux autoclaver pendant 20 min sans problèmes.


Cordialement,

[invitec9f0f895]

Salut

attention il ne faut pas conserver les levures a 4°C! ca pose des tonnes de problemes. Notamment l'apparition de nombreux prions dans la cellule.
Le mieux est alors de mettre du parafilm autour de ta boite et tu la laisses sur ta paillasse en attendant le retour de ton directeur.

YOyo

[invite8c0cc995]

Hello,

Au pire, tu fais ton milieu tou(e) seul(e). Voici un petit protocole qui peut t'être utile :


Ca vient d'ici : http://www.bristol.ac.uk/biochemistry/stephens/ypd.pdf

Tu peux autoclaver pendant 20 min sans problèmes.


Cordialement,

Dans ce cas il y a de l'Uracile dans le milieu, et il n'y a plus de pression de sélection.

[invite8c0cc995]

Salut

attention il ne faut pas conserver les levures a 4°C! ca pose des tonnes de problemes. Notamment l'apparition de nombreux prions dans la cellule.
Le mieux est alors de mettre du parafilm autour de ta boite et tu la laisses sur ta paillasse en attendant le retour de ton directeur.

YOyo

Concernant les prions, je ne savais pas. Moi je stockais juste mes levures à +4°C pour conserver des levures avec mes plasmides d'intérêt (lors des mes cribles doubles hybrides). Donc je relancais une culture liquide quand nécessaire, et je faisais une extraction de plasmide. Dans ce cas, tu penses que les prions peuvent être génant ?
Moi j'avais plus de problème avec ma souche qui produisait un métabolite secondaire de couleur rouge toxique (issu de la voie de synthèse de l'adénine) si je la laissais trop longtemps à température ambiente. A forte dose c'est toxique pour la levure.

[invite17a570c1]

Ah, m*rde, t'as raison pour l'Uracile, je me disais bien que c'était trop simple pour être la bonne solution


Cordialement,

[invitec9f0f895]

Concernant les prions, je ne savais pas. Moi je stockais juste mes levures à +4°C pour conserver des levures avec mes plasmides d'intérêt (lors des mes cribles doubles hybrides). Donc je relancais une culture liquide quand nécessaire, et je faisais une extraction de plasmide. Dans ce cas, tu penses que les prions peuvent être génant ?

Si c'est pour faire une extraction de plasmide derriere, je ne pense pas que ca pose de probleme. Maintenant si tu veux étudier la physiologie ou faire un crible en utilisant des cellules restées a 4°c la je le déconseillerai.

Moi j'avais plus de problème avec ma souche qui produisait un métabolite secondaire de couleur rouge toxique (issu de la voie de synthèse de l'adénine) si je la laissais trop longtemps à température ambiente. A forte dose c'est toxique pour la levure.

Si tu n'a pas besoin d'ade2 comme crible coloré, tu peux rajouter un peu d'adenine dans tes milieux, les colonies resteront blanches.

YOyo

[invite8c0cc995]

Si tu n'a pas besoin d'ade2 comme crible coloré, tu peux rajouter un peu d'adenine dans tes milieux, les colonies resteront blanches.

YOyo

Je faisais du YPD + Ala, mais malgré cela, les colonies devenait rose puis rouge au bout d'1 à 2 semaines. C'était jolie, même mes stocks de levure congelées étaient rose...

[invitec9f0f895]

Je faisais du YPD + Ala, mais malgré cela, les colonies devenait rose puis rouge au bout d'1 à 2 semaines. C'était jolie, même mes stocks de levure congelées étaient rose...

+ Ala? tu veux dire ade j'imagine?
Mais c'est vrai qu'avec le temps elles finissent par rosir. Ceci etant dit, il se dit que des levures maintenu au froid avec un plasmide au bout d'un certain temps ne repartent pas!...
Autant les congeler a -80° si on n'en n'a pas 150

YOyo

[invite8c0cc995]

au temps pour moi, c'était Ada

En ce qui concerne le stockage au -80°, effectivement, je l'ai fait apres avoir testé mes 200 clones en b-gal et éliminer les 80% les moins bons. Mais pour ce faire, effectivement vu que je ne pouvais gérer seul 200 cultures d'un coup, et pour ne pas perdre de clones ou avoir a gérer le repiquage de 200 clones toutes les semaines j'avais mis les boites à 4 degrés, et en reprenant un peu de colonie pour encemencer mon milieu ! Dans cas, certaines levures sont restées 15j au froid avant d'etre ensemencé en culture liquide pour faire un test b-gal. Bon tout cela est derriere moi maintenant, mais penses tu que les prions peuvent géner dans le cas de test b-gal.

Je confirme qu'apres un certains temps au froid les levures ne repartent plus, mais bon, faut au moins attendre 2 mois.

[invitec9f0f895]

Salut

Il y a un nouveau prion qui est SWI+ qui est un facteur de remodelage de la chromatine. Dans ce cas la on peu toujours imaginer que cela va induire des faux positifs dans ton crible double hybride, mais bon la quantite doit etre negligeable si tu veux mon avis.

YOyo