Concentration Primers

[invite02cefc91]

Bonjour à tous !

J'aurais de nouveau besoin de quelques renseignements pour mes QPCR.

J'ai terminé le design de mes primers et je réfléchissais à la concentration à laquelle je vais les commander.

A votre avis, quelle est la gamme de concentration nécessaire pour les primers dans un QPCR ? Je suis en train de regarder un guide technique qPCR de chez Sigma, et il parle de 200 à 500 nM par primers, je trouve cela énorme, ca va revenir à cher les primets du coup !!!!

Merci de votre aide



Bonne journée
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[invite8c0cc995]

C'est a peu près cela. Moi je tourne aux alentours de 0.5µm (500nM).
Ne confonds pas nM et ng !
En général quand je commande chez Sigma, j'ai de quoi faire des stock à 100µM (de 0.5 à 1ml), donc il y a de quoi faire ! Je dilue mes stocks à 5µM, et de chaque je prends 1/10 du volume final de la PCR (à optimiser selon les primers).

Cordialement,

[invite02cefc91]

Merci,


Je me suis rendu comme de mon erreur en nM et nmol, faudra juste que je fasse gaffe aux volumes que je vais rajouter quand je recevrais mes primers ...


Autre question qui me vient : Je vais du SyberGreen, on a pas besoin de primers spécifiques ? Je sais pour d'autres techniques il faut des primers spécifiques qPCR, mais en SyberGreen je crois pas ?



Merci encore

[piwi]

Non pas de primers spécifiques pour Sybrgreen.

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite8c1e373f]

Autre question qui me vient : Je vais du SyberGreen, on a pas besoin de primers spécifiques ? Je sais pour d'autres techniques il faut des primers spécifiques qPCR, mais en SyberGreen je crois pas ?

le SYBR Green est un intercalant de l'ADN, il va donc se lier à l'ADN double brin de façon non spécifique (il se lie donc aussi aux dimères de primers). Donc ça te permet de quantifier les produits amplifiés grâce à un couple d'amorces classiques.

(Cette technique diffère de la technologie TaqMan, qui justement, utilisent des amorces marquées, et ainsi tu vas détecter le produit spécifique de ton amplification.
Il existe d'autres techniques qui utilisent des amorces marquées.)

[invite8c0cc995]

Le seul point sur lequel tu dois faire attention avec le SybrGreen, c'est qu'à l'inverse du Taqman qui ne détecte que l'amplification de la séquence cible, tout ce qui est double brin est quantifié, y compris les dimers de primers et les produits aspécifiques. Il faut donc s'arranger pour que tes primers ne dimérisent pas, et qu'ils soient suffisement spécifiques. Donc des primers avec le même taux de GC, pas trop long, en évitant les G ou C en 3', les répétitions de bases (genre GGG etc...), et qui amplifient une séquence de 150-350 bp max. Bref faut etre un peu plus minucieux que pour une PCR classique. Et toujours vérifier l'efficacité d'amplification des primers.

[gorben]

Autre question qui me vient : Je vais du SyberGreen, on a pas besoin de primers spécifiques ? Je sais pour d'autres techniques il faut des primers spécifiques qPCR, mais en SyberGreen je crois pas ?

Salut,

Sans etre specifique pour le Sybrgreen, c'est quand meme mieux pour la qPCR si tu commandes des oligos purifies HPLC ou PAGE... ca evite des fois de mauvaises surprises ! C'est sur que si tu dois commander 10 couples ca va faire cher, mais pour un couple je pense que ca vaut le coup.

A+