primer extension

[invitef69f87d5]

Bonjour!!
je me demande comment une primer extension peut indiquer si un gène est polycistronique...
Est-ce que l'on détermine seulement si les deux extrémintés 5' des deux ARNm sont identiques?
merci d'avance pour vos réponses..
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[Yoyo]

Salut

j'imagine que si tu fais une extension a partir d'une amorce cituée dans le deuxieme gene, alors si tu a un transcrit polycystronique ta reveres transcription va aller bien au dela de l'extremité 5' supposée.

Ceci dit je pense qu'une PCR classique te donnerai exactement les memes résultats en etant beaucoup plus simple a mettre en oeuvre.

Yoyo

[invitef69f87d5]

D'accord.. Merci..
Tu m'as bien éclairé, Je n'y étais pas du tout...

[gorben]

Salut,

Ceci dit je pense qu'une PCR classique te donnerai exactement les memes résultats en etant beaucoup plus simple a mettre en oeuvre.

Desole, mais ca ne te donne pas du tout les meme infos... Comment avec une PCR mettre en evidence un ARN polycistronique?
Tu dois au depart obtenir les ADNc donc faire une reverse transcription. A ce niveau la autant marquer l'amorce et voir si l'ADNc est plus grand que celui que l'on attend. Pas besoin de faire une PCR dessus, et c'est tout autant facile (et en plus moins de probleme de contamination par de l'ADNg)

A+

[A voir en vidéo sur Futura]

[Yoyo]

Salut,



Desole, mais ca ne te donne pas du tout les meme infos... Comment avec une PCR mettre en evidence un ARN polycistronique?
Tu dois au depart obtenir les ADNc donc faire une reverse transcription. A ce niveau la autant marquer l'amorce et voir si l'ADNc est plus grand que celui que l'on attend. Pas besoin de faire une PCR dessus, et c'est tout autant facile (et en plus moins de probleme de contamination par de l'ADNg)

A+

Salut

si ca te donne les meme infos, des que tu marques radioactivement une molecule il faut prendre tout un tas de précaution reglementaire, ce qui complique singulierement la manip.
De plus la PCR est beaucoup plus sensible et ne necessite aucun marquage radioactif.
Pour avoir vu et fais pas mal de primer extension, les resultats ne sont malheureusement que rarement super clairs, entre les initiations multiples, les structures secondaires qui bloquent la RT...c'est parfois difficile de déméler le faux du vrai. Par contre si ta PCR amplifie un signal alors tu es certain que ton ARN est polycistronique.

YOyo

[gorben]

Pour avoir aussi fait les deux, je trouve la primer extension plus rapide. A la place de la radioactivite tu peux marquer les oligos par un fluorophore (type sequencage ADN) et l'envoyer comme une sequence. Tu obtiens la taille de ton produit, et ca t'a pris une heure de manip et un timbre poste.
Avec la PCR, tu dois d'abord verifier avant ta RT que ton ARN est DNA free donc une PCR, puis souvent un deuxieme traitement a la DNase, puis la PCR pour determiner si l'ARN est polycistronique ou non... ca fait une journee de manip, 2 PCR, 2 gels avec du BET etc...
De plus, avec la PCR tu dois choisir les amorces et donc avoir deja predit le terminateur potentiel. Avec une PCR en point final, tu ne peux pas etre sur non plus que l'amplification que tu vois est un reel transcrit polycistronique, et pas juste une fuite du terminateur precedant qui n'a absolument aucune incidence biologique (la on passe en RTqrtPCR, et je pense qu'on est d'accord pour dire que ce n'est VRAIMENT pas le bon choix pour montrer que le transcrit est polycistronique ).

A+

[Yoyo]

salut

visiblement ca depend beaucoup des labos dans lesquels ont se trouve
sinon, je ne connaissai pas cette possibilité.

A la place de la radioactivite tu peux marquer les oligos par un fluorophore (type sequencage ADN) et l'envoyer comme une sequence.

Ca me parait super pratique, tu as de references? un protocole? quand tu dis que tu l'envoies comme une séquence c'est a dire ?


merci pour les infos

YOyo

[gorben]

Salut,

J'ai pas souvenir d'une reference, j'avais mis ca au point apres avoir discute avec la personne responsable du sequencage de mon centre.
J'ai utilise cette methode pour 2 choses :
- protection a l'exonucleaseIII (resultats nickel avec les concentrations ADN/prot identique a l'EMSA)
- Primer extension avec 3 ug (ou peut etre 5 ug) d'ARN et un protocole de base (superscriptIII, invitrogen)

J'avais commande mes oligos chez sigma et leur ai demande de greffer un fluorophore en 5' de chacun (TET et FAM selon mes souvenirs).

Ensuite tu les passes sur un ABIprism (J'avais utilise un 310 en analyse de fragment, pas sequencage) contre un marqueur de poids moleculaire. En fait c'est tout bete, il suffit de dire que tu veux la taille du fragment, et tu prepares ton mix avec formamide + echantillon+marqueur de poids moleculaire (TAMRA 500 par exemple), et le sequenceur te donne 40 min plus tard la taille de ton produit marque.
Ca marche tres bien pour les deux applications citees, on doit pouvoir faire egalement de la quantification puisque la surface du pic est proportionnelle a la quantite de l'echantillon.
J'avais commence a develloper sur le meme principe du footprint, mais la these etait trop courte

A l'epoque j'avais le matos sous la main, donc c'etait plus simple. Mais tu peux egalement envoyer ton echantillon chez n'importe quel centre de sequencage, en leur precisant que c'est de l'analyse de fragment.

Il doit probablement trainer des ref sur pubmed a ce sujet, reste qu'a les trouver...

A+

[gorben]

Juste pour preciser, la methode est je dirais sensible a +/- 1 base (voire 2 bases). Donc pour du "gros oeuvre" c'est genial (transcrit polycistronique, protection exonuclease, localisation de promoteur etc). Par contre si il s'agit de determiner precisement le +1 de transcription, je reste sceptique (peut etre avec un vrai pro derriere le sequenceur ca peut le faire vu que l'appareil est cense etre precis a la base pret !).

A+

[Yoyo]

Super!
merci beaucoup pour les indications. J'ai un ABI310 sous la main, je pourrais donc tester sans probleme
juste une question, la migration se fait en POP6? ou tu utilises un autre polymere?
pourquoi tu utilises deux fluorophores differents?

Le marqueur tu l'avais acheté ou? j'imagine que lui aussi est marqué? En fait je ne me suis jamais servi du sequenceur de cette maniere la, mais ca me semble une technique prometteuse.

Merci pour les infos.

Yoyo

[gorben]

Les deux fuorophores c'etait pour la protection a l'exoIII.
Le marqueur de PM c'etait le TAMRA 500 (TAMRA pour le fluorophore et 500 pour la taille max). J'en avais deja de dispo, je ne l'ai pas achete mais il me semble que c'etait chez perkin (ou applied biosystem peut etre).
Pour la migration, je n'en ai malheureusement plus aucune idee, mais je sais que l'analyse de fragment etait expliquee dans le manuel du 310. J'avais suivis le protocole.

On peut aussi migrer en condition native pour analyser des fragments style SSCP. Bref cet appareil est une merveille

A+