primer dimer
Salut à tous,
Voilà, je suis nouvelle sur ce site et j'ai une question à propos de la PCR et les dimers de primers. Sur quels paramètres jouer pour les éliminer? Et dans quel sens? Car j'en ai dans mes PCR actuelles, ils sont à peu près toujours à la même taille par rapport à mon marqueur de taille (un peu en dessous de 50pb).
Je vous remercie
Caro
La formation de dimères est due à des conditions de PCR trop permissives, après évidemment un design d'amorces non optimum. Les paramètres que l'on peut modifier sur un qPCR pour diminuer les dimères sont la température d'hybridation (la diminuer), puis la concentration en MgCl2 (la diminuer), et évaluer le ratio sonde/amorces en concentration.
Si tous ces essais ne changent rien et que la présence de dimère reste dommageable pour la PCR (car un dimère en Sybr Green, ça se voit souvent, mais en TaqMan, beaucoup moins) avec une éventuelle inhibition ou limitation de la réaction de PCR par la réaction parasite, alors il faudra repenser le système d'amorces et repartir sur un nouveau design.
Bon courage
Pour dessiner des amorces qui ne font pas (PCR quanti) ou pas trop (PCR point final) d'appariements sur elles-mêmes ou sur l'autre amorce de la PCR, il faut les aligner en antiparallèles avec ton programme de manipulationqs de séquences (DNA Strider, NTI Vector, etc.) ou bien essayer avec des sites spécialisés tels que Primer3.
En général, il faut éviter les régions palindromiques, des richesses en A/T ou en G/C locales ou générales.
Bon courage
