cellules compétentes DH5a

[invite544b7bfe]

Bonjour,
en vu de clonner un fragment de gene, jai commencé par préparer des cellules compétentes DH5a, par traitement avec la glace: 20min dans la glace suivies par des lavages avec le glycerol. Aprés la transformation par électroporation, j'ai trouvé des colonies sur la boite LB+Amp de controle négatif( cellules DH5a sans vecteur) sur les autres boites LB+ Amp+ IPTG+ X-Gal j'ai trouver des colonies blanches et des colonies bleu.
En quoi peut me gener la présence de ces colonies résistantes à l'amp sans etre transformées?
Merci
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[piwi]

Vous n'avez pas travaillé avec un plasmide recemment?
Si ca se trouve vous avez une contamination de votre environnement (pipettes) avec un vecteur qui transforme vos bactéries à votre insu (de très petites quantités de plasmide suffisent à transformer).

Sinon c'est votre stock de DH5alpha qui est déjà transformé.

Cordialement,
piwi

[inviteb20069dc]

le vecteur possede un gene de resistance a l'ampicilline et apporte donc la resistance à l'ampicilline quand il transforme une bactérie DH5a. Or si la bacterie est deja resistante a l'ampicilline avant la transformation, tu ne peux pas distinguer les bactéries transformées des bacteries non transformées resistantes à l'ampicilline.

[invitec9f0f895]

salut

Le fait d'avoir des colonies sur ta boite controle indique que soit tu t'es trompé et tu as mis du plasmide la ou il ne fallait pas! soit que tu as une legere contamination (ca depend aussi du nombre de colonies que tu as).
Ensuite pour ta manip, ce sont les colonies blanches qui vont t'interesser. Or si ton contaminant est blanc aussi tu ne pourras pas les distinguer des vrais bon clones.

YOyo

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite17a570c1]

En gros, si ton contrôle rate, tu recommences...

Bon courage!