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Questions Materials & Methods...



  1. #1
    MaliciaR

    Questions Materials & Methods...


    ------

    Bonjour,

    J'ai une publi très intéressante sous la main, mais mon petit cerveau a du mal avec certaines choses Le titre : Eucaryotic genome evolution through the spontaneous duplication of large chromosomal segrments, Koszul et al., EMBO 2004

    Primo, qu'est-ce qu'un centromeric plasmid? Je le soupçonne capable de se répliquer tout seul comme un grand chez S. cerevisiae, mais encore? Ils disent avoir utilisé pRS416 de chez Stratagene, mais je n'ai pas réussi à le trouver dans les Products

    Secundo, qu'est-ce gene dosage assay?

    Tertio, qu'est-ce non reciprocal terminal translocation? Je veux dire, il me paraît quelque part que si une translocation se produit à l'intérieur (càd pas au niveau d'une région chromosomique terminale), elle sera réciproque, l'expression "conversion génique" me vient aussi... Mais j'ai plutôt la mauvaise impression de m'embrouiller complètement

    Merci bien

    Cordialement,

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  4. #2
    Yoyo

    Re : Questions Materials & Methods...

    salut

    un plasmide centromerique est un plasmide a bas nombre de copie car il possede un centromere. Il y en a de une a 3 copies dans une levure.
    Par contre il ne faut pas croire que ces plasmides soient stables. Ils se perdent facilement.

    UN "gene dosage assay"... faudrait voir la phrase dans sa globalité mais j'aurais tendance a penser que c'est une experience qui vises a déterminer le nombre de copie d'un gene.

    Une translocation terminale non reciproque, est l'echange de l'extremité d'un bras du chrosome mais dans un seul sens.
    Par exemple le ChrI donne une partie de son bras droit au chrII mais ce dernier ne donne rien du tout au ChrI (d'ou le non reciproque).

    YOyo

  5. #3
    MaliciaR

    Re : Questions Materials & Methods...

    Citation Envoyé par Yoyo Voir le message
    salut

    un plasmide centromerique est un plasmide a bas nombre de copie car il possede un centromere. Il y en a de une a 3 copies dans une levure.
    Par contre il ne faut pas croire que ces plasmides soient stables. Ils se perdent facilement.
    Merci
    Tu veux bien approfondir sur le "il est à bas nombre de copies car il possède un centromère"?

    UN "gene dosage assay"... faudrait voir la phrase dans sa globalité mais j'aurais tendance a penser que c'est une experience qui vises a déterminer le nombre de copie d'un gene.
    La phrase est : Using a gene dosage assay for growth recovery in S. cerevisiae, we demonstrate that a majority of revertant strains resulted from... etc.

    Une translocation terminale non reciproque, est l'echange de l'extremité d'un bras du chrosome mais dans un seul sens.
    Par exemple le ChrI donne une partie de son bras droit au chrII mais ce dernier ne donne rien du tout au ChrI (d'ou le non reciproque).

    YOyo
    Donc, peut-on parler de conversion génique ici?

    Merci, Yoyo

    Cordialement,
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  6. #4
    Yoyo

    Re : Questions Materials & Methods...

    Citation Envoyé par MaliciaR Voir le message
    Merci
    Tu veux bien approfondir sur le "il est à bas nombre de copies car il possède un centromère"?
    Il y a deux types de plasmides chez la levure. Ceux qui ont des origines "2microns" qui sont des plasmides multicopie (100a 300 copies par noyaux); et les plasmides qui ont une origine "ARS/CEN" qui sont present en une ou 3 copies par noyaux en raison de la présence d'un centromere sur le plasmide.
    je sais pas trop quoi te dire de plus...


    La phrase est : Using a gene dosage assay for growth recovery in S. cerevisiae, we demonstrate that a majority of revertant strains resulted from... etc.
    ca veut dire qu'il faut avoir une certaine quantité de genes pour que la levure survive (d'ou probablement l'utilisation d'un plasmide centromerique) afin d'éviter de surexprimer le gene présent dessus en raison du grand nombre de copie du plasmide.

    Donc, peut-on parler de conversion génique ici?

    Merci, Yoyo

    Cordialement,
    Oui on pourrait en effet.

    YOyo

  7. A voir en vidéo sur Futura
  8. #5
    MaliciaR

    Re : Questions Materials & Methods...

    Citation Envoyé par Yoyo Voir le message
    Il y a deux types de plasmides chez la levure. Ceux qui ont des origines "2microns" qui sont des plasmides multicopie (100a 300 copies par noyaux); et les plasmides qui ont une origine "ARS/CEN" qui sont present en une ou 3 copies par noyaux en raison de la présence d'un centromere sur le plasmide.
    je sais pas trop quoi te dire de plus...
    Ok, je vois très bien! En fait, on nous en a parlé en classe, mais avec tes termes qui sont différents de ceux de la publi. Donc, je ne suivais rien

    ca veut dire qu'il faut avoir une certaine quantité de genes pour que la levure survive (d'ou probablement l'utilisation d'un plasmide centromerique) afin d'éviter de surexprimer le gene présent dessus en raison du grand nombre de copie du plasmide.
    Pour éviter qu'il y ait un cas de suppresseur, par exemple?

    Cordialement,
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  9. #6
    Yoyo

    Re : Questions Materials & Methods...

    exactement pour eviter les suppresseurs multicopies.

    YOyo

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  11. #7
    MaliciaR

    Re : Questions Materials & Methods...

    Citation Envoyé par Yoyo Voir le message
    exactement pour eviter les suppresseurs multicopies.

    YOyo


    Merci beaucoup, Yoyo!

    Cordialement,
    An expert is one who knows more and more about less and less.

  12. #8
    MaliciaR

    Re : Questions Materials & Methods...

    Bonjour,

    Je remets un truc sur la planche.
    Dans cette publi, les gars on réussi à faire un truc 'achement sympa : démontrer que le génome de S. cerevisiae subit des duplications spontanées de grands segments chormosomiques. Ceci est bel et bon
    Puis, vers la fin, très précautionneusement, les gars émettent la proposition de généraliser ce phénomène à tout le génome, pas seulement au chromosome 15 qu'ils ont regardé. Du coup, ils choppent 191 mutants délétés présentant des retards de croissance et regardent chez combien parmi eux il y a des ré-arrangements chromosomiques semblables à ceux chez le chromosome 15; effectivement, ils en trouvent.
    Ma question serait : est-ce qu'il y a un autre phénotype que l'on pourrait regardé (autre que le phénotype "défaut de croissance") pour étudier ce genre de phénomènes? J'avais pensé à des mutants du cycle, mais ce ne sont pas des mutants "simples"... Ce que je veux dire c'est : est-ce qu'on peut d'abord étudier d'autres phénotypes mutants avant de généraliser? (Même si les auteurs généralisent de façon très douce et pas du tout définitive )

    Merci pour vos idées

    Cordialement,

    P.S. Sinon, pour ce qui concerne la translocation non réciproque terminale, je crois qu'on lui applique le terme BIR aussi, non?
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  13. #9
    MaliciaR

    Re : Questions Materials & Methods...

    Gniiiii, personne n'a d'idée...? Je ne suis pas la seule alors

    Cordialement,
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  14. #10
    piwi

    Re : Questions Materials & Methods...

    T'as un phénotype X, tu choppes des mutants spontanés ou induits qui présentent le phénotype et tu regardes si il y a un réarrangement chromosomique.
    J'aurais tendance à dire que peu importe le phénotype après tout. Il ne te sers qu'a faire ton crible. Y a juste quelques limites à cela. Peut être que le gène responsable du phénotype du papier (si il n'y en a qu'un) présente un hot spot.

    Voilà quelques idées comme ça en passant.
    Je sers la science et c'est ma joie.... Il parait.

  15. #11
    MaliciaR

    Re : Questions Materials & Methods...

    Beh justement, quel phénotype?

    Ce qui est regardé ce sont les ré-arrangements spontanés de grands fragments du génome restaurant un phénotype sauvage (ici, défaut de croissance).
    Perso, je serais tentée de prendre des mutants non induits, histoire de vraiment pouvoir faire une généralisation.

    En ce qui concerne le hot spot... Ils disent à la fin (dernier paragraphe de la discussion) qu'il se peut que la restauration du phénotype dans le cas précis étudié puisse être due au fait qu'il y a une pression de sélection forte sur le gène regardé (un gène ribosomal).

    Je me dis qu'on ne peut pas prendre n'importe quel phénotype mutant. Mais aujourd'hui, ce n'est pas ma journée "grande concentration" alors me demande pas d'expliquer pourquoi

    Merci

    Cordialement,
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  16. #12
    piwi

    Re : Questions Materials & Methods...

    Ben à priori, tu cribles tes mutants pour trouver tes revertants. Si le phénomène de recombinaison est général et se produit dans tout le génome de la levure, alors pourquoi y aurait il à faire un choix?
    La limite c'est que ton phénotype soit facilement screenable et le phénomène connu pour savoir où regarder. Un retard de croissance c'est simple, tes révertants ce sont les colonies de taille normale.

    Bon je ne suis pas un spécialiste de la génétique de la levure.
    Je sers la science et c'est ma joie.... Il parait.

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  18. #13
    MaliciaR

    Re : Questions Materials & Methods...

    Citation Envoyé par piwi Voir le message
    Ben à priori, tu cribles tes mutants pour trouver tes revertants. Si le phénomène de recombinaison est général et se produit dans tout le génome de la levure, alors pourquoi y aurait il à faire un choix?
    Recombinaison?
    Je parle de duplication, moi
    En ce qui concerne le phénotype, je me dis la même chose. Mais j'ai dit ça au prof à qui j'ai posé la question (avant de la poser ici) et il m'a dit : "Ah nion nion, il faut un phénotype simple"...

    La limite c'est que ton phénotype soit facilement screenable et le phénomène connu pour savoir où regarder. Un retard de croissance c'est simple, tes révertants ce sont les colonies de taille normale.
    Exact

    Bon je ne suis pas un spécialiste de la génétique de la levure.
    Moi non plus

    Merci et bonne nuit!
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  19. #14
    doubleD

    Re : Questions Materials & Methods...

    salut
    j'avais eu cet article à présenter en master 2 (comme quoi ce doit être un grand classique).
    Si je me rapelle bien, le seul reproche que l'on peut faire est qu'ils introduisent une énorme pression de sélection vu le gène qu'ils ont muté (ou délété je me rappelle plus).

    Après pour l'histoire du phénotype je crois que c'est tout simplement un problème pratique: une mutation un peu délétère va entrainer un retard de croissance, et comme l'a dit piwi, y a rien de plus simple que de regarder des révertants d'un retard de croissance. A mon avis c'est surtout pour une histoire de facilité pratique qu'on se base sur des retards de croissance.

  20. #15
    MaliciaR

    Re : Questions Materials & Methods...

    Hello,

    Citation Envoyé par doubleD Voir le message
    salut
    j'avais eu cet article à présenter en master 2 (comme quoi ce doit être un grand classique).
    Ha, excellent! Je suis en M1, mais ça n'empêche : c'est un grand classique.


    Si je me rapelle bien, le seul reproche que l'on peut faire est qu'ils introduisent une énorme pression de sélection vu le gène qu'ils ont muté (ou délété je me rappelle plus).
    J'ai trouvé d'autres reproches à faire aussi
    Primo, je ne comprends pas du tout leur manière de traiter les ratios. Je m'explique. Ils disent qu'un ration est établi comme suit :

    ratio genomique =

    (en nombre d'ORF)

    Ce que cela suppose, c'est que j'ai un ratio > 1, mon révertant à des ORF supplémentaires.
    Or, ce que je vois dans l'article (légende de la Fig.1), c'est un ratio allant de -0,5 à +1,5 (et dans un cas, de -1 à +2). Et moi rien comprendre à chiffres négatifs Comment se fait-il que je puisse avoir un ratio négatif? Et ce truc, 0,5? Je réfléchissais ainsi : si j'ai 3 copies d'une ORF donnée chez le révertant contre 2 seulement, ça me donne un ratio de 1,5. Ok. Mais Comment avoir un ratio égal à -0,5? Ou ce n'est pas une valeur de ratio, mais une valeur absolue et là cela voudrait dire que j'ai une copie de l'ORF donnée en moins? Franchement, je sèche là.

    Secundo, dans la partie traitant des duplications intrachromosomiques en tandem direct, les gars prennent 2 exemples de duplications. Bon, c'est cool, les deux sont orientées ainsi. Mais pourquoi les deux en questions sont de tailles inférieure ou égale à 100 kb, alors que la taille de pratiquement 2/3 des duplications intrachromosomiques qu'ils ont mises en évidence est supérieure à 100 kb? Personne n'en pipe un mot...

    Tertio, dans la discussion, ils parlent à un moment des moyennes et des écart-types de tailles de duplications observées. Ils disent que ces valeurs sont différentes en comparaison avec celles établies pour les duplications ancestrales. Je veux bien, mais nulle part on parle de la taille des duplications considérée. Une duplication segmentale peut être de taille entre 5 et je-ne-sais-pas-combien kb, comment peut-on établir des valeurs de comparaison sur des trucs aussi différents? Dans le sens où ici ils ne disent pas dans quelle fourchette de tailles ils se mettent pour calculer ces valeurs...

    J'ai fini de critiquer Outre ces 3 points, je trouve que c'est un exemple excellent de comment avec de la génétique classique majoritairement on peut arriver à mettre en évidence des mécanismes aussi fondamentaux que ceux-là. (Fin de l'envolée lyrique )

    Après pour l'histoire du phénotype je crois que c'est tout simplement un problème pratique: une mutation un peu délétère va entrainer un retard de croissance, et comme l'a dit piwi, y a rien de plus simple que de regarder des révertants d'un retard de croissance. A mon avis c'est surtout pour une histoire de facilité pratique qu'on se base sur des retards de croissance.
    Et y a-t-il d'autres phénotypes présentant une telle facilité pratique? En fait, c'est ça ma question sur les phénotypes.

    Merci

    Cordialement,
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  21. #16
    MaliciaR

    Re : Questions Materials & Methods...

    Je sais, je me parle toute seule, mais bon... (Comme on dit, au moins je parle à quelqu'un d'intelligent )

    Vive le fond obsessionnel. Il se trouve que ce truc-là (je me recite, c'est maaaal...) m'a turlupiné :
    Citation Envoyé par MaliciaR Voir le message
    Secundo, dans la partie traitant des duplications intrachromosomiques en tandem direct, les gars prennent 2 exemples de duplications. Bon, c'est cool, les deux sont orientées ainsi. Mais pourquoi les deux en questions sont de tailles inférieure ou égale à 100 kb, alors que la taille de pratiquement 2/3 des duplications intrachromosomiques qu'ils ont mises en évidence est supérieure à 100 kb? Personne n'en pipe un mot...
    Je me suis demandée si des duplications de taille plus importante que 100 kb auraient une influence sur leur stabilité et si elles seraient sujettes à des modifications diverses et variées au cours de la méiose, par exemple (vu que S. cerevisiae aime beaucoup faire de la recombinaison ).
    Et voici ce que m'a dit PubMed. Les auteurs se sont posés la même question, voici la réponse :
    As shown in Figure 6A, the global viability of the meiotic products decreases when the size of the block increases. This is illustrated by a significant increase in the number of tetrads with only three viable spores, the number of tetrads with four viable spores decreasing concomitantly. This result suggests that large tandem duplications alter meiotic segregation of chromosomes, which may lead to abnormal and unviable meiotic products.
    ...
    Our results suggest that, in cases of large tandem duplications, DSB ends would be preferentially redirected into intrachromatid rather than intersister recombination.
    Le reste est ici, si cela intéresse quelqu'un

    Cordialement,
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