compatibilité OriS et Ori de PMB1 dans un même plasmide?

[invite140a8207]

Bonjour,

j'ai vraisemblablement réussi à créer un nouveau plasmide à partir de deux autres plasmides. Voici sa composition :
- gènes de résistance au chloramphénicol et à l'ampicilline,
- HIS3 : sélection auxotrophique chez la levure
- CEN6 : centromère de S.cerevisiae
OriS, repE, sopA, sopB, sopC (de pBElo BAC 11)
et l'origine de réplication de PMB1.

Avec ce vecteur je vais cloner des grand fragment de type YAC et BAC, je me demandais si la présence de OriS et de l'origine de réplication de PMB1 pouvait poser des problèmes dans la transmission du plasmide aux bactéries filles, des pb de recombinaison ou autre.

Merci par avance pour vos réponses.

Sardus
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[Yoyo]

salut

normalement coli ne supporte pas la presence de deux ori sur la meme molecule.

Yoyo

[MaliciaR]

Voici sa composition :
- gènes de résistance au chloramphénicol et à l'ampicilline,
- HIS3 : sélection auxotrophique chez la levure
- CEN6 : centromère de S.cerevisiae
OriS, repE, sopA, sopB, sopC (de pBElo BAC 11)
et l'origine de réplication de PMB1.

Bonjour,

Il y a quelque chose que je ne comprends pas : pourquoi as-tu besoin de ces 3 origines? Comme a dit Yoyo, E.coli n'aime pas trop plus d'une ori...

Avec ce vecteur je vais cloner des grand fragment de type YAC et BAC

Tu veux cloner des vecteurs dans ton nouveau plasmide? Je t'avoue être un peu désorientée là...

Cordialement,

[piwi]

Il veut cloner les inserts que l'on pourrait introduire dans ces vecteurs. Pas les vecteurs allons....

Sinon, le centromère est un classique pour le clonage en eucaryote, donc bon, il ne gène pas. Ca fait "seulement" deux Ori procaryotes.
Moi aussi je crains qu'il y ait un Ori de trop à OK Coral, l'un des deux va devoir disparaitre! Je ne veux pas voir ca...

Cordialement,
piwi

[A voir en vidéo sur Futura]

[MaliciaR]

Il veut cloner les inserts que l'on pourrait introduire dans ces vecteurs. Pas les vecteurs allons....

Beh 'e n'en sais rien... Il y a plein de trucs que l'on peut faire avec un super plasmide

Sinon, le centromère est un classique pour le clonage en eucaryote, donc bon, il ne gène pas. Ca fait "seulement" deux Ori procaryotes.
Moi aussi je crains qu'il y ait un Ori de trop à OK Coral, l'un des deux va devoir disparaitre! Je ne veux pas voir ca...

Cordialement,
piwi

Oui, le centromère ne devrait pas gêner. Mais quel intérêt d'avoir un super plasmide pour cloner des trucs que l'on peut cloner dans un plasmide normal?
Excusez la pôv inculte qui je suis

Cordialement,

P.S. Et puis, si je ne me trompe, OriPMB1 est une ori bas nombre de copies, alors qu'OriS?

[Yoyo]

Je vois qu'on est tous du meme avis. pour avoir fait des clonage pUC vs pBC je n'ai jamais vu de plasmide ayant recupéré les deux ori...

d'un autre coté je s'il a reussi a obtenir son plasmide c'est que c'est viable... encore faut il etre certain du plasmide et que ca ne soit pas le bordel dans la sequence...

YOyo

[MaliciaR]

Je ne suis pas certaine qu'il s'agisse d'un vrai plasmide... Dans le sens où j'ai déjà vu une nana (une ctastrophe ambulante d'ailleurs) réussir à cloner un petit vecteur dans un grand... Je crois que c'est le seul clonage qu'elle ait réussi
Mais le truc avait une seule ori, pas deux...

Cordialement,

[invite140a8207]

Bonsoir et merci pour vos réponses,
le but c'était de faire des recombinaisons chez la levure et de pouvoir électroporer directement le YAC dans les bactéries. Le vecteur possède 2 ori procaryotes car je l'ai construit en ligant des fragments de deux vecteurs différents (et je croyais avoir supprimé une des 2 oris mais après séquençage elles y sont toutes les deux).
J'ai obtenu des colonies de bactéries qui ont poussé avec ce plasmide. Ensuite j'ai prcoédé à des recombinaisons chez la levure et j'ai électroporé les YACs extraits de la levure dans des E. coli DH10bêta. Et là j'ai des résultats bizarres, je ne sais pas si je n'ai pas perdu l'insert, car j'avais des colonies positives (criblage pcr) et après une maxi prep, j'ai obtenu de bonnes quantités d'ADN mais plus de réponse par PCR...(j'ai bien mis des témoins) Serais-ce à cause des 2 oris?

Merci encore

[piwi]

Un bonne chose serait peut être de linéariser ton plasmide pour au moins vérifier qu'il a la taille attendu. Quelques restrictions bien senties ne serait pas non plus du luxe.
Ca donne tout de même de bons indices quant à une couille dans le potage.

Reste que tes deux origines sont un problème et que tu devrais en éliminer une.

Cordialement,
piwi

[invite140a8207]

J'ai justement digéré et je lance une FIGE demain. En parallèle, je vais faire une hybridation des colonies (positives par PCR), avec une sonde spécifique de l'insert souhaité, pour une seconde vérif.
La suite au prochain épisode...
Merci et Bonne soirée!

[MaliciaR]

Tiens-nous au courant, très intéressante, cette histoire!

Cordialement,