Intégration dans un plasmide

[invitedb923d71]

Bjr!
Savez vous comment s'effectue l'intégration d'un gène dans un plasmide bactérien? (Le gène a déjà réussi a pénétré dans la bactérie grâce à la transformation)
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[invite38f0db9e]

Bjr!
Savez vous comment s'effectue l'intégration d'un gène dans un plasmide bactérien? (Le gène a déjà réussi a pénétré dans la bactérie grâce à la transformation)

Salut,
L'intégration de séquence d'intéret ( un ou plusieurs gènes ) se fait par technique d'ADN recombinant. En gros, tu vas utiliser des endonucléases ( ou enzymes de restriction) qui font créer des extrémitées cohésives ( pouvant être "ligasé" par une ADN ligase ) sur ta séquence d'intérêt et sur ton vecteur plasmidique. Une fois que tu as digéré avec tes endonucléases, tu peux procéder à la ligation de ton vecteur (le plasmide) et de ton insert (ta séquence).
Si tu veux que j'explique le processus en détail, étape par étape, dis le moi, je le ferai avec plaisir. Le processus est un peu plus complexe que ce que je viens te décrire, mais en gros ca ressemble à ca.

[invitedb923d71]

Et l'intégration dans un plasmide est systématique?

[gorben]

Salut,

Non, c'est pas systematique. Ca depend de la qualité de tes digestions, de la taille de ton vecteur et de ton insert. Par contre, ce genre de construction se fait in vitro. Tu transformes ensuite la bacterie par ton plasmide. Pour integrer un fragment d'ADN dans un plasmide deja dans une cellule, je dirais que tu ne peux le faire que par recombinaison homologue, mais c'est bcp plus compliqué et j'ai jamais entendu d'une telle manip pour modiifier des plamisdes.

[A voir en vidéo sur Futura]

[invitedb923d71]

Salut,

Non, c'est pas systematique. Ca depend de la qualité de tes digestions, de la taille de ton vecteur et de ton insert. Par contre, ce genre de construction se fait in vitro. Tu transformes ensuite la bacterie par ton plasmide. Pour integrer un fragment d'ADN dans un plasmide deja dans une cellule, je dirais que tu ne peux le faire que par recombinaison homologue, mais c'est bcp plus compliqué et j'ai jamais entendu d'une telle manip pour modiifier des plamisdes.

Et uniquement in vitro? L'intégration d'un gène (dans un plasmide) qui a réussi a pénétré dans une bactérie ne peut se faire qu'in vitro?

[invitef1b4a1e8]

Bonjour,

L'ADN circulaire pénètre plus facilement dans des bactéries (préparées pour la transformation : on dit qu'elles sont "compétentes") que l'ADN linéaire.
Et un gène seul serait rapidement perdu : non répliqué et dégradé (sauf en cas de recombinaison homologue, ce qui est un événement "assez" courant chez les levures, chez les bactéries, je ne sais pas...?). Au contraire, un plasmde contient une origine de réplication, et sa forme circulaire le protège des exonucléases.

C'est pour cette raison qu'on utilise un vecteur d'ADN circulaire pour introduire un gène dans une bactérie. Ce vecteur est souvent un plasmide modifié (avec de nombreux sites d'intégration possibles, un promoteur fort avant ces sites, des gènes de sélection pour pouvoir distinguer les bactéries qui ont intégré le plasmide...)
Donc on fabrique un plasmide recombinant in vitro (en y introduisant le gène voulu) et on transforme les bactéries avec cette construction.

On transfecte quelquefois des cellules eucaryotes avec des acides nucléiques linéaires, des ARN viraux par exemple. (Qu'en est-il du taux de transfection? j'imagine qu'il doit être plus faible qu'avec un acide nucléique circulaire?)
Mais ces ARN sont traduits et codent notamment pour une protéine permettant la réplication virale : ils ne sont donc pas perdus.
Je ne sais pas si on fait de même avec les bactéries...
J'imagine qu'un ADN linéaire serait dégradé puisque ce n'est pas sa forme normale dans une bactérie (de même qu'un ADN linéaire sans télomères dans une cellule eucaryote?)

[invite9e6bc039]

Et uniquement in vitro? L'intégration d'un gène (dans un plasmide) qui a réussi a pénétré dans une bactérie ne peut se faire qu'in vitro?

Non, elle peut se faire dans la cellule bactérienne par recombinaison homologue... c'est d'ailleurs une "nouvelle" technique de clonage mise au point par Stephen Elledge. On en a parlé y'a qq semaines.

Voici l'article:


Nature Genetique. 2005 Mar;37(3):311-9. Epub 2005 Jan 30. Related Articles, Links
Click here to read
MAGIC, an in vivo genetic method for the rapid construction of recombinant DNA molecules.

Li MZ, Elledge SJ.


Mais en routine, dans les labos, on fait ça In vitro car c'est très bien huilé, les tampons, temps d'incubation etc sont optimisés par les compagnies qui vendent ces produits... ça marche très bien.

[gorben]

Il existe aussi sur des plasmides (ou dans le genome) des structures de type integron qui "captent" des genes et les integrent dans le plasmide.

Sinon, je suis bien interessé par la discussion sur l'article ci-dessus... qq un aurait le lien sous la main?

[invitef1b4a1e8]

Non, elle peut se faire dans la cellule bactérienne par recombinaison homologue... c'est d'ailleurs une "nouvelle" technique de clonage mise au point par Stephen Elledge. On en a parlé y'a qq semaines.

Il existe aussi sur des plasmides (ou dans le genome) des structures de type integron qui "captent" des genes et les integrent dans le plasmide.

Très intéressant!
Excusez mon ignorance, je savais pas que ça existait, tout ça...

Est-ce que le mécanisme impliquant les intégrons est connu?

[invite9e6bc039]

Il existe aussi sur des plasmides (ou dans le genome) des structures de type integron qui "captent" des genes et les integrent dans le plasmide.

Sinon, je suis bien interessé par la discussion sur l'article ci-dessus... qq un aurait le lien sous la main?

Ici:
http://www.nature.com/cgi-taf/DynaPa...=doi1113765304


Mais c'est payant, c'est Nature Genetique.

Toute fac' en France devrait avoir l'abonnement, si tu es vraiment pressé, je peux te l'envoyer ==> MP

[invite38f0db9e]

C'est pour cette raison qu'on utilise un vecteur d'ADN circulaire pour introduire un gène dans une bactérie. Ce vecteur est souvent un plasmide modifié (avec de nombreux sites d'intégration possibles, un promoteur fort avant ces sites, des gènes de sélection pour pouvoir distinguer les bactéries qui ont intégré le plasmide...)
Donc on fabrique un plasmide recombinant in vitro (en y introduisant le gène voulu) et on transforme les bactéries avec cette construction.

La souche bactérienne la plus utilisée en tant que vecteur est Escherichia coli K12. Son système de recombinaison est altéré ce qui permet de prévenir les réarrangements incontrôlés des clones. De plus, ces souches sont dépourvues d’endonucléases de restriction pour ne pas altérer l'insert.

J'imagine qu'un ADN linéaire serait dégradé puisque ce n'est pas sa forme normale dans une bactérie (de même qu'un ADN linéaire sans télomères dans une cellule eucaryote?)

Je ne pense pas qu'il soit possible d'insérer dans une bactérie hôte un ARN linéaire, sauf si on utilise un phage comme vecteur. Dans ce cas si, tes rendements sont drastiquement augmentés car la transformation de bactérie compétente est relativement peu rentable. Les bactériophages (utilisés en tant que vecteur) infectant les bactéries sont eux, par opposition, vraiment plus efficace ! Mais dans ce cas ci, les objectifs de ta manipulation sont autres que le simple fait de vouloir faire exprimer un gène par une bactérie.

[gorben]

Ici:
http://www.nature.com/cgi-taf/DynaPa...=doi1113765304


Mais c'est payant, c'est Nature Genetique.

Toute fac' en France devrait avoir l'abonnement, si tu es vraiment pressé, je peux te l'envoyer ==> MP

Non ca va merci je le prendrais demain au labo
Merci !

Pour les integron, oui c'est trés connu comme systeme mais pas utilisé comme tel (enfin je pense) comme outil de biologie moleculaire pour faire du clonage ou autre. Certaines methode (Datsenko & wanner) utilisent par contre une integrase pour augmenter la frequence de recombinaison homologue d'un gene dans un genome (mais la on s'eloigne de ta question). En lancant une recherche sur pubmed, tu pourras trouver de bonnes revues sur ce mecanisme (un bon livre de biomol peut aussi te renseigner je pense). Je suis desolé de pas t'en dire plus mais je pas specialiste de ce domaine et j'ai pas envie de dire de betise!