Bonjour à tous,
J'ai une question, Je me sers, dans mon protocole de PCR, de la solution Q fournie dans les kits qiagen pour PCR. Je voudrais savoir si quelqu'un sait ce qu'il y a dans cette solution, et surtout si il y a du DMSO!!! qiagen n'a pas voulu me le dire!!!!
Merci
Salut,
As-tu déjà regardé dans le manuel d'utilisation? Normalement, les compositions y sont
Cordialement,
la composition de cette solution est tenue secrète par Qiagen, ils n'ont rein écrit dans leur manuel.
Bonjour,
Euh... dans ce cas, je ne vois pas comment on pourrait savoir ce qu'il y a dedans
A la limite, essaie de faire tes PCR avec et sans DMSO ajouté (par toi) et tu verras bien si ça donne quelque chose
Cordialement,
Il est vrai que Qiagen reste evasif sur la composition de ces réactifs…
A tout hasard est ce que tu utilises le Kit Rneasy Mini pour l’extraction de l’ARN, pourrais tu m’expliquer quel est le principe ? Merci d’avance.
Désolée de ne pas pouvoir t'aider, je ne travaille pas avec de l'ARN.
Merci quand même! Bon courage pour tes PCRs!
Après une tite recherche sur le site de Qiagen :
"Q-Solution facilitates amplification of difficult templates by modifying the melting behavior of DNA. Use of this unique reagent will often enable or improve suboptimal PCR (see figure "Amplification of Difficult Templates with Q-Solution"). Unlike DMSO and other PCR additives, Q-Solution is used at a defined working concentration with any primer–template system and is not toxic."
On peut en conclure que la Solution Q ne contient pas de DMSO.
Merci Sam!!!!
de rien
Bonjour Kinette,Envoyé par Kinnette2910
Il est vrai que Qiagen reste evasif sur la composition de ces réactifs…
A tout hasard est ce que tu utilises le Kit Rneasy Mini pour l’extraction de l’ARN, pourrais tu m’expliquer quel est le principe ? Merci d’avance.
pour ma part, je ne travaille pas avec le kit Rneasy Mini mais avec le kit Rneasy Midi. Le principe est le suivant:
- Lyser les membranes cellulaires avec un tampon RLT-beta mercaptoéthanol
- Centrifuger et récupérer le surnargeant dans lequel se trouve les ARN (le culot contenant les débris cellulaires est éliminé)
- Ensuite tu transfères ce surnageant sur la colonne de filtration: à l'aide de centrifugation et de différents lavages avec différents tampons (RPE, RW1) tu filtres ton surnageant. Les ARN restent accrocher sur la colonne.
- Il te suffit ensuite d'éluer ton ARN avec de l'eau RNase free
Concernant le rôle exact des tampons utilisés dans les lavages, je ne peux pas trop t'en dire plus: Qiagen, c'est vrai, restant très secret sur la formulation de leurs produits.
Pour le RNeasy Mini kit, le principe doit être sensiblement le même: seules les quantités doivent varier.
En espérant avoir pu t'aider
Hello
Il ne faut juste pas oublier, avant la mise sur la colonne, la précipitation des acides nucléiques avec de l'éthanol
Il y a aussi une étape de dégradation des ADN avec de la DNase pour ne garder que les ARN
Bonjour,
effectivement Marie_Eve a raison: il ne faut pas oublier la précipitation des acides nucléiques avec de l'alcool (à 70 % je crois). Mea Culpa!
Il y a effectivement aussi une étape a la DNase. Mais celle-ci n'est cependant pas obligatoire: tout dépend de la manip que tu veux réaliser après avoir extrait tes ARN. Si avoir un peu d'ADN ne dérange pas, alors tu peux passer sur cette étape.
Tout d'abord merci Marie Eve et merci Moumoutte,
Merci pour vos précisions, j'aimerai aussi savoir si c'est possible comment les ARNs se fixent de manière selective sur la colonne de Silice et pourquoi l'eau permet l'élution? Est ce que c'est une sorte de chromatographie échangeuse d'ions? Est ce que les ARNs restent fixés par le biais de leur queues poly A? (Je rédige le matériel et méthode de mon rapport de stage... Et ca me fait me poser plein de question...!!!
Bonne soirée à toutes tous.
Bonjour,comment les ARNs se fixent de manière selective sur la colonne de Silice et pourquoi l'eau permet l'élution? Est ce que c'est une sorte de chromatographie échangeuse d'ions? Est ce que les ARNs restent fixés par le biais de leur queues poly A? (Je rédige le matériel et méthode de mon rapport de stage... Et ca me fait me poser plein de question...!!!
Bonne soirée à toutes tous.
je dois reconnaître qu'il y a quelques mécanismes qui m'échappent aussi, mais, répétons-le, les secrets bien gardés de Qiagen y sont sans doute pour quelque chose.
Tout ce que je peux te dire, c'est:
-les tampons RLT et RW1 contiennent du guanidium isothiocyanate. C'est un sel chaotropique qui en milieu acide et alcoolique attire les molécules d’eau permettant une réaction d’adsorption des acides nucléiques sur la silice. Ici, les particules de silice sont disposées sur colonne et la séparation s'effectue par centrifugation. C'est un composé qui permet donc la séparation acides nucléique-protéines.
- l'eau doit certainement être légèrement basique et dénuée de sel pour permettre l'élution
- une chose est sûre: les ARNs ne restent pas fixés par le biais de leur queues poly A. Ici, tu extraits des ARN TOTAUX et pas seulement des ARNm (pourvu eux d'une queue polyA). Ces ARN totaux se fixent sur la colonne de silice grâce au thiocyanate de guanidine. Le principe n'est donc pas non plus une chromatrographie échangeuse d'ions.
Voilà, c'est à mon avis un peu comme ça que ça doit se passer dans cette colonne!!
J'espère avoir pu t'aider
Bonne courage et bonne chance pour ton rapport!
Tout ce que je peux te dire, c'est:
-les tampons RLT et RW1 contiennent du guanidium isothiocyanate. C'est un sel chaotropique qui en milieu acide et alcoolique attire les molécules d’eau permettant une réaction d’adsorption des acides nucléiques sur la silice. Ici, les particules de silice sont disposées sur colonne et la séparation s'effectue par centrifugation. C'est un composé qui permet donc la séparation acides nucléique-protéines.
- l'eau doit certainement être légèrement basique et dénuée de sel pour permettre l'élution
- une chose est sûre: les ARNs ne restent pas fixés par le biais de leur queues poly A. Ici, tu extraits des ARN TOTAUX et pas seulement des ARNm (pourvu eux d'une queue polyA). Ces ARN totaux se fixent sur la colonne de silice grâce au thiocyanate de guanidine. Le principe n'est donc pas non plus une chromatrographie échangeuse d'ions.
Ok, c'est plus clair!
Merci pour ta réponse...
