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PCR et fluorescence...




  1. #1
    harlequin

    PCR et fluorescence...

    Bonjour,

    J'effectue actuellement un stage dans une boite de chimie qui souhaite ouvrir un pôle de microbiologie dans le cadre de l'étude de mycobactéries et champignons. Je sais déjà que je vais utiliser la pcr (pour prouver la présence de certaines souches) et la microscopie à fluorescence (pour le dénombrement). Le petit souci est que je suis plutôt chimiste et que même si je connais un peu le principe de ces méthodes, je ne sais pas trop le matériel nécessaire pour effectuer cela. Mes questions sont donc: Que faut-il pour réaliser une pcr et une observation avec un microscope à fluorescence (une liste détaillé serait l'idéal)? Qui peut me fournir le matériel? Est-il possible de transformer un microscope leica dm 2500 pour la fluorescence?

    -----


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  3. #2
    parfais

    Talking Re : pcr et fluorescence...

    Ben pour la PCR
    1) il faut un thermocycler (à defaut un bain marie et un bac à glace...)
    2) une enzyme taq polymérase (celle qui reconstruit le fragment d'adn à haute température permettant de garder les brin séparés)
    3) de l'ADN à amplifier
    4) des amorces quise fixeront sur la portion d'adn à amplifier

    Microscopie par fluorescence?? pas pour la PCR en tout cas. En revanche après la PCR tu fait une electrophorèse pour voir quels sont les tailles de tes fragments amplifiés et pour les faire apparaitre soit : Gel d'electrophorèse contenant du BET
    Soit tu trempe ton gel après migration dans un bain de BET
    et tu passe le gel sous UV en prenant une Photo.

  4. #3
    MaliciaR

    Re : pcr et fluorescence...

    Salut et bienvenue

    Sais-tu ce que tu observeras en microscopie?
    Concernant le matériel, c'est à la boîte de le fournir, pas à toi Et je pense qu'il y aura quelqu'un pour t'expliquer comment ça marche, au pire reviens demander


    Cordialement,
    An expert is one who knows more and more about less and less.


  5. #4
    oknam

    Re : pcr et fluorescence...

    pour la PCR, pour l'avoir moi meme réalisé en TP... je peux dire que c'est loin d'etre compliqué. une fois qu'on t'aura montré les étapes et le matériel, c'est vraiment simple.

    ne t'inquiéte pas, tu devrais y arriver sans problème...

  6. #5
    MaliciaR

    Re : pcr et fluorescence...

    Hello,

    Citation Envoyé par oknam Voir le message
    pour la PCR, pour l'avoir moi meme réalisé en TP... je peux dire que c'est loin d'etre compliqué. une fois qu'on t'aura montré les étapes et le matériel, c'est vraiment simple.

    ne t'inquiéte pas, tu devrais y arriver sans problème...
    Euh... Je ne serais pas aussi catégorique là-dessus Les PCR en TP c'est une chose (tout est préparé par les enseignants, on fait des trucs qui fonctionnent à pratiquement tous les coups,...) et les PCR que tu fais au labo c'en est une autre. Sans parler du fait que des PCR type qPCR peuvent être assez difficiles à comprendre et mettre en place (cf. les demandes d'explication dessus ).
    Ceci dit, il y a une chose claire : si l'on s'y prend proprement, au moins on limite le biais dû à celui/celle qui remplit les tubes


    Cordialement,
    An expert is one who knows more and more about less and less.

  7. A voir en vidéo sur Futura
  8. #6
    harlequin

    Re : pcr et fluorescence...

    bonjour,
    la fluorescence doit servir à pratiquer une coloration dapi...mais je ne sais si le microscope que j'ai (leica dm2500) peut suffir pour l'observation en fluorescence. En fait si je sais qu on peut pas le faire mais je voudrais savoir si il était possible de le "trafiquer" pour que ca puisse marcher.
    Merci.

  9. #7
    harlequin

    Re : pcr et fluorescence...

    Pour l'observation, on veut juste quantifier les microbes sans distinction particulière et il me semble que la fluorescence DAPI soit plus efficace qu'une culture classique...
    Y'a un truc que je dois clarifier, c'est à moi de mettre en place le plan et y'a pas de microbiologiste y'a que des chimistes donc pas d'assistance comme en travaux pratique, et c'est aussi à moi de trouver les fournisseurs.
    Voila merci.

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  11. #8
    harlequin

    Re : pcr et fluorescence...

    re,
    un dernier détail, il me faut également le matériel pour faire l'extraction d'adn et celui pour l'electrophorèse.
    merci

  12. #9
    MaliciaR

    Re : pcr et fluorescence...

    Bonjour,


    Citation Envoyé par harlequin Voir le message
    bonjour,
    la fluorescence doit servir à pratiquer une coloration dapi...mais je ne sais si le microscope que j'ai (leica dm2500) peut suffir pour l'observation en fluorescence. En fait si je sais qu on peut pas le faire mais je voudrais savoir si il était possible de le "trafiquer" pour que ca puisse marcher.
    Merci.
    Euh... tu veux dire que tu coloreras au DAPI et tu observeras en fluorescence ensuite J'avoue ne pas m'y connaître en microscopie pour pouvoir t'aider sur ton Leica, désolée... Mais je pense qu'il y aura des gens pour te filer un coup de main dans les quelques jours



    Citation Envoyé par harlequin Voir le message
    re,
    un dernier détail, il me faut également le matériel pour faire l'extraction d'adn et celui pour l'electrophorèse.
    merci
    Pour l'extraction de l'ADN plasmidique ou génomique? Toutes les boîtes du genre Qiagen, Invitrogen, etc. proposent des kits pour faire ça, donc là tu n'as pas trop de soucis. Il faut juste que tu regardes de combien de réaction tu auras besoin : chaque kit est généralement proposé pour 20 ou 50 ou 100 réactions. Pour les extraction, tu as juste besoin du kit (ou protocole "maison" que tu mets en place ou trouves sur le net ) et d'une centrifugieuse "de paillasse" (vitesse max 13200 - 15000 rpm). Puis, tu congèles à -20°C.
    Pour l'électrophorèse, il te faudra du matos : les appareils d'électrophorèse. Ceux de chez BioRad ne sont pas mal, il y a la place pour couler plein de gels d'un coup Il te faudra aussi du bleu de bromophénol pour faire le tampon de charge pour la migration (il faut que je regarde la recette exacte...), le BEt pour la révélation + la lampe aux UV pour la visualisation.

    Au fait, tu as des tubes pour faire tes réactions? On a tous des Eppendorf de 1.5 et 2 ml... Pareil, il te faut des tubes spéciaux pour les PCR ou des barettes (ensemble de 8 tubes de 20 µl chaque) ou des plaques de 96 puits. Ceci dit, tu as des micropipettes?

    Bon courage


    Cordialement,
    An expert is one who knows more and more about less and less.

  13. #10
    harlequin

    Re : pcr et fluorescence...

    En fait, la DAPI sert à observer tout ce qui contient de l'adn. On utilise un colorant qui se fixe sur les cellules. Ensuite, quand tu envoies de la lumiere violette sur le colorant, il te renvoie de la lumière bleu ( exitation et emission).
    Pour le matériel, on considère que je pars de 0.
    Au fait, c'est quoi la difference entre adn génomique et plasmidique?
    Je crois qu il est prévu de ciblé des mycobactéries et des organismes que l'on trouve dans des ours d'eau.

  14. #11
    harlequin

    Re : pcr et fluorescence...

    désolé pour les fautes...

  15. #12
    harlequin

    Re : pcr et fluorescence...

    Est ce que du DNAzol et de l'ethanol sont suffisant pour l'extraction? A quoi sert la proteinase K? QU est ce que t appelles (MaliciaR) un protocole maison?
    Merci

  16. #13
    MaliciaR

    Re : pcr et fluorescence...

    Citation Envoyé par harlequin Voir le message
    En fait, la DAPI sert à observer tout ce qui contient de l'adn. On utilise un colorant qui se fixe sur les cellules. Ensuite, quand tu envoies de la lumiere violette sur le colorant, il te renvoie de la lumière bleu ( exitation et emission).
    Je connais le DAPI Sauf que mes colorations avaient été rouges


    Au fait, c'est quoi la difference entre adn génomique et plasmidique?
    L'ADN génomique c'est l'ADN du "chromosome" bactérien (ordre de grandeur chez E. coli : 4*106 pb), alors que l'ADN plasmidique est celui des particules autoréplicatives appelées plasmides qui peuvent être contenues normalement dans les bactéries et qui portent des gènes de résistance à des antibiotiques (essentiellement) et à des métaux lourds (ordre de grandeur pour un plasmide classique pBR322 : 3*103 pb). Donc, suivant ces tailles, tu utilises des méthodes d'extraction différentes (phénol-chlorophorme pour l'ADN génomique et lyse alcaline (ou miniprep) pour le plasmidique, très habituellement).
    Ensuite, vu que tu vas travailler sur des Mycoplasma, il faut voir : leurs génomes sont très petits comparés aux génomes bactériens habituels et je ne connais pas très bien la méthodologie dans ce cas. Mais déjà renseigne-toi sur ce que tu vas extraire, ce sera plus logique de chercher en sachant


    Citation Envoyé par harlequin Voir le message
    Est ce que du DNAzol et de l'ethanol sont suffisant pour l'extraction?
    Oui, c'est ok pour l'ADN génomique.


    A quoi sert la proteinase K?
    C'est un Ser-protéase qui hydrolyse les liaisons peptidiques au niveau des C-ter lorsque les aa les formant sont aliphatiques, aromatiques ou hydrophobes. Je l'ai utilisée dans des extractions d'ADN génomique bactérien et viral à partir de sang total et j'en ai de mauvais souvenirs au niveau des qPCR... Mais bon, je ne pense pas que tu as à t'inquiéter, mon cas est plutôt une exception vu ce que j'avais lu dessus


    QU est ce que t appelles (MaliciaR) un protocole maison?
    Merci
    J'appelle "protocole maison" tout ce qui est protocole non commercialisé (pour le distinguer des kits).


    Cordialement,
    An expert is one who knows more and more about less and less.

  17. #14
    harlequin

    Re : pcr et fluorescence...

    On cible des pseudomonas, des staphylococcus, legionella (pneumophila), mycobacterium, escherichia coli des trucs dans ce genre.
    Au fait, comment je fais pour trouver des amorces???

  18. #15
    parfais

    Re : pcr et fluorescence...

    Les amorces tu les commande .... il faut avoir accès soit à du génome séquencé (cf banques de gènes) soit à un gène qui s'amplifie chez des espèces proches.

    Un truc me tracasse... Se lancer dans une entreprise comme celle la tout seul entouré que de chimiste... Faut sacrément en avoir!!!!
    Peut être que le mieux ce serait de faire un stage (voir une journée de découverte) dans un labo de biologie d'abord.
    En tout cas bon courage!

    Pour l'electrophorèse: il faut une cuve, de quoi faire des gels d'agarose, un marqueur de migration (produit que l'on met et qui à des fragment dont la taille est connue...ca permet de savoir la taille des fragment amplifiés.

    Ha autre chose! attention au prix de certain produits... la TAQ polymérase est assez chère mais il en faut très peu et c'est essentiel.

  19. #16
    IngDr

    Re : pcr et fluorescence...

    Citation Envoyé par harlequin Voir le message
    bonjour,
    la fluorescence doit servir à pratiquer une coloration dapi...mais je ne sais si le microscope que j'ai (leica dm2500) peut suffir pour l'observation en fluorescence. En fait si je sais qu on peut pas le faire mais je voudrais savoir si il était possible de le "trafiquer" pour que ca puisse marcher.
    Merci.
    Le plus simple est de contacter directement le représentant qui vous a vendu le microscope Leica. A priori c'est peut etre possible de customiser le dm2500 en fluorescence.

    http://www.leica-microsystems.com/Microscopes
    Application Oriented Design
    The Leica DM2500 can also be configured to fit your application.
    The Leica DM2500 can be configured with a variety of Optics and contrast techniques, including new designed Fluorescence axis for the demanding optical and contrast requirements of Pathology and other biomedical Research applications..


    Sinon il faut aussi prévoir le master mix pour la PCR (le tampon, contenant les dNTP, MgCl2, ...), les consommables plastiques (tube eppendorf), et les micro pipettes (2ul, 20ul, 100ul), etc...
    La encore, cela a un cout, tout comme l'agarose, ...
    De même il faut un transilluminateur UV pour visualiser le gel

    En ce qui concerne les amorces, mieux vaut vous entourer de spécialistes, car on ne se lance pas comme ca dans la Bio Moleculaire. Je rejoints Parfais à 100%, et même n'est il pas possible d'établir une collabo dans un premier temps avec des labos de bio ? Surtout que c'est dans l'air du temps les partenariat privé/public...


    @MaliciaR :je te déroule le DAPI rouge ....

  20. #17
    harlequin

    Re : pcr et fluorescence...

    Bonjour,
    Au début ca devait être de la chimie strict mais finalement on m'a demandé de faire aussi le lancement du pôle micro bio.
    Y'a un labo de sous traitance que va aussi travailler la dessus et ma principale mission sera de rédigé le plan et de faire les prelevements. Néanmoins dans un premier temps il faut que j'installe le materiel pour la pcr et la fluoresence. Je connais grossièrement ce qu'il faut mais les détails genre tubes eppendorf...c'est autre chose. Si MaliciaR ne l'avait pas mentioné, j'y aurai même pas pensé. Mais puisque vous dites qu il y a des kits, je n'aurai qu'a voir avec les fournisseurs.
    Ensuite, en ce qui concerne la journée "espionnage en labo", j'y pensé et j'ai même un rdv en fin de semaine.
    Enfin pour le microscope, je suis tombé sur un lien il y a quelques jours qui devait me conduire soi disant au support conseil et technique mais laisse tombé, je pensai que j'aurai le droit à une MaliciaR version optique mais là je suis tombé sur une meuf, sa tête c'est le vide interstellaire tellement qu'il y rien dedans, je la verrais bien dans le mur de 1vs100...Bref, cette fois je vais utiliser le lien officiel (merci IngDr) et je verrai bien.
    En tout cas merci pour toutes vos réponses.

  21. #18
    MaliciaR

    Re : pcr et fluorescence...

    Hello,

    Citation Envoyé par harlequin Voir le message
    Y'a un labo de sous traitance que va aussi travailler la dessus et ma principale mission sera de rédigé le plan et de faire les prelevements.
    Oui, j'espère pour toi... Il faut absolument que tu voies comment ça s'organise pour les prélèvements : je sais que pour bosser sur des prélèvements totaux faut être bien rodé et surtout, en fonction du matériel sur lequel tu vas travailler, faire gaffe à ta sécurité. Je bossais sur du sang contaminé et des prélèvements de plaies l'an dernier, du coup, on m'a fait tous les vaccins possibles et imaginables (j'avais les bras comme Stalone et je me sentais comme une passoire...).
    Donc, ce que tu es en droit de demander c'est qu'on te fournisse des échantillons déjà pré-traités pour que tu ne fasses que la PCR dessus, pas que tu te tapes toute la préparation préalable.


    Néanmoins dans un premier temps il faut que j'installe le materiel pour la pcr et la fluoresence. Je connais grossièrement ce qu'il faut mais les détails genre tubes eppendorf...c'est autre chose. Si MaliciaR ne l'avait pas mentioné, j'y aurai même pas pensé. Mais puisque vous dites qu il y a des kits, je n'aurai qu'a voir avec les fournisseurs.
    Le matos pour la PCR implique pas mal de choses... Les tubes, les pipettes, le thermocycler (c'est le nom de la machine ), les appareils à électrophorèse, le BEt et la lampe pour la révélation avec sa petite imprimante pour les photos de gel
    Les tubes sont commandés à part (une astuce : ils sont durs à ouvrir, ça fait chier parfois, alors, pour les 1,5 et 2 ml, je les fais cuire au four pendant une nuit à 90°C. Le matin ils sont tout moelleux ).
    Les kits... Il faut que tu passes par la gestion de ta boîte, qu'ils ouvrent un compte, et tout ça, là j'avoue ne pas trop connaître.


    En tout cas merci pour toutes vos réponses.
    Bon courage et n'hésite pas à revenir, si on peut t'aider, ce sera avec plaisir


    Cordialement,
    An expert is one who knows more and more about less and less.

  22. #19
    doneP

    Re : pcr et fluorescence...

    Bonjour Harlequin
    Comme quelques personnes précédemment je suis surpris qu'un "stagiaire" doivent monter un labo de biologie moléculaire?
    Outre le défit technique: l'appareillage (centri, cycler), le matériel d'extraction , d'amplification...la formation du personnel (manipuler une pipette paraît facile...)
    Défit scientifique : pouvoir vérifier la nature, la quailté de ce que l'on a extrait, il faut souvent utiliser plusieurs protocoles et avoir une culture scientifique assez avancée...
    Il y a le défit de l'hygiène dans le labo: la biomol c'est avant tout une hygiène irréprochable pour éviter les contaminations (hotte pour stériliser les pipette, les gants, le eppendorf...)
    Il y a aussi le défit sécurité: on ne manipule pas le BET n'importe comment (Je crois déjà qu'il faille des autorisations), il y a des chartes, c'est un produit hautement cancérigène, il faut une salle (au moins une paillasse) à part.
    Je suis peut être plus dur que mes camarades...
    Bonne chance quand même et surtout n'hésite pas à faire de la recherche bibliographique sur le sujet, les vendeurs auront toujours des choses à te vendre.

    DoneP

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