PCR en temps réel ou Q-PCR

[invite689529bc]

Bonjour,

J'ai une grande interrogation au sujet du Q-PCR et des amorces. Je sais qu'il est possible de designer des primers avec un logiciel, de façon à ce que les primers chevauchent une séquence intronique et exonique.
Pourtant comment expliquer que le Q-PCR se fasse sur de l'ADNc, obtenu après RT-PCR et qu'on nous demande de faire un traitement à la Dnase I pour éliminer toute contamination par l'ADNc. Dans ce cas ne serait-il pas plus exacte de dire que le Q-PCR se fait sur l'ADNgénomique et non sur le complémentaire ? De fait, la Dnase permettrait de se départir de l'ADNc, non ?

Merci pour votre aide
belouga7
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[invitef9169c33]

Oulla!

Si je devais mettre de la DNAse, je la mettrais avant la RT histoire de bien éliminer toute trace d'ADN dans ma fraction d'ARN totaux, ferait la RT des ARNm puis la qPCR de l'ARNm d'intérêt en dernier...

C'est pas ce que tu as dans ton protocole?

[invite689529bc]

Oui en effet, je m'excuse erreur de ma part, pas grand chance de faire un Q-PCR si je traite mes échantillons après le RT.
Mais normalement, mes amorces de Q-PCR ne devraient-elles pas donner un produit de taille différente quand je fais un PCR sur du génomique et sur de l'ADNc ? Pourtant dans mon cas les deux produits obtenus ont le même poids, ce qui est fou. Je me demande si je loupe un train dans la compréhension de la technique ou si il s'agit simplement d'une contamination ?

Je m'obstine avec mon boss, qui me dit qu'il est possible sur un PCR classique, c'est-à-dire avec une quantité de matériel somme tout limitée, de faire une amplification d'un produit de plusieurs kb, il me semble que la polymérse se détacherait au bout d'un moment et que le nombre de dNTP pourrait venir à manquer.

[invitef9169c33]

Pour l'hypothèse émise dans ton 2nd paragraphe, je te conseillerai de voir dans la biblio ce que ça donne pour d'autres gènes de taille équivalente mais honnetement, j'en sais rien.

Sinon, oui les produits des PCR de l'ADN génomique et ADNC devraient être différents... mais normalement, si tu as bien mis ta DNAse avant la RT, pas de contamination possible

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite7a72b4ea]

Bonjour,
Si tes primers sont sur le même exon, alors tu amplifiras aussi bien le cDNA que l'ADNg contaminant, générant ainsi des amplicons de même taille. C'est pourquoi il est recommendé de travailler sur une jonction exon-exon et/ou de faire un traitement DNAse.
Bon courage!