Bonjour
Nous travaillons actuellement sur la détection du virus MS 2 phage par RT-PCR en temps réel. Pourriez vous nous donner des indications sur les amorces à choisir et sur la composition du mix réactionel. Nous avons un deuxième problème: comment réaliser une gamme étalon à partir d'ARN de virus ? Comment passer des µg/µL (concentration de notre ARN) en UG/L ? Merci
Pour le choix de tes amorces, utilise le site pubmed afin de trouver des gènes d'interêts. Ensuite cherche (toujours sur pubmed) les séquences codantes de ton gène.Envoyé par sodia
Enfin, tu peux utiliser l'outils http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi
Tu rentres ta séquence CODANTE du gène que tu souhaites ainsi que les différents paramètres que tu souhaite choisir. Il te sortira un pannel de primers.
Après, il n'y a plus qu'à passer la commande chez ton fournisseur et à les tester.
UG/L --> désolé mais UG ca ne me dit rien par contre ...
mhhh enlève moi un doute: c'est ta PCR que tu fais en temps réel ? pas ta RT-PCR ?
Bonjour,
pour convertir les µg en "nombre de copies" (je ne sais pas ce que veux dire UG), il faut diviser la masse de phage (par ex. 1µg) par la masse molaire du génome du phage.
Pour cela, il faut la masse molaire de chaque nucléotide et la séquence de ton phage ou au moins leur masse moléculaire moyenne et son nombre de paires de bases.
nA = nombre de "A", MA = masse molaire de A
nC = nombre de "C", MC = masse molaire de C
nG = nombre de "G", MG = masse molaire de G
nT = nombre de "T", MT = masse molaire de T
masse molaire génome phage = nAxMA + nCxMC + nGxMG + nTxMT
ou (si tu n'as pas la séquence détaillée) : masse moléculaire moyenne d'un nucléotide x nombre de bases (attention si ADN double brin, il faut multiplier par 2)
Re-bonjour,
sinon, il y a des indications (en anglais) ici :
http://www.ambion.com/techlib/append/na_mw_tables.html
M.W. = (An x 329.2) + (Un x 306.2) + (Cn x 305.2) + (Gn x 345.2) + 159ª
Annaïck.
Bonjour
Merci pour vos réponses.
UG = Unité Génome (nombre de copies)
Ne faut il pas multiplier le nombre de mole par le nombre d'avogadro (pour passer des µg/µL en nombre de copies) ?
Nous effectuons bien une Reverse Transcriptase PCR en temps réel
Fun, je savais pas que ca se faisait ... comme quoi =)
Merci de l'info
