PCR en temps réel

[invite12bf6e4e]

Hello

en cherchant sur internet le principe de la pcr quantitative taqman, je me rend compte qu'il faut 2 paires d'amorces : 1 pour l'amorçage et 1 taqman. Or moi pendant mon stage, j'ai utilisé que les sondes taqman. j'ai obtenu des bons résultats mais je me demande si ils sont valides du coup? et je me pose la question que je m'étais jamais posée : comment la taq polymérase commence la polymérysation : au hasard à partir du simple brin ou il faut impérativement du double brin c'est à dire adn + amorce?

il ya l'autre technique de pcr en temps réel qui me pose problème : en sonde d'hybridation, les sondes ne sont pas hydrolysées par la taq alors que c'est le cas en taqman (enfin si j'ai bien compris) et je me demande pourquoi? les sondes d'hybridation émettent de la fluorescence quand elles sont cote à cote, c'est bien ça?

je suis un peu dans le brouillard
merci.
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[invite4ff9937a]

Bonjour

Je ne pense pas que tu ais utilisé uniquement une sonde taq man tu as forcément dû utiliser aussi des primers ( sondes d'hybridation pour que la polymérase commence.)
J'apelle donc "primers ou amorce" les sondes qui permettent le commencement de la polymérisation et "sondes" la sonde portant les fluorochromes.

La polymérase a forcément besoin d'une amorce, de plus la spécificité de la réaction dépend de l'hybidation spécifique de ces amorces!!

Dans la méthode Taq man il ya a deux molécules à chaque extrémité de la sonde qui fait en moyenne un dizaine de nucléotides, les deux molécules sont donc trés proches mais pas accolées!! lorsque les deux molécules sont trés proches aucune fluorescence n'est possible car l'une empéche l'autre de fluorescer c'est le phénoméne de "quenching" cependant lorsque la sonde s'hybride elle est dégradée par la polymérase ( qui polymérise a partir des primers) les deux molécules sont donc "libérées" l'une de l'autre et il y a donc émission de fluorescence dont l'intensité est proportionelle à la quantité d'ADN

j'éspére avoir été clair et avoir répondu à ta question

au plaisir

marc

[invite12bf6e4e]

en effet j'ai bien relu mes notes et j'ai utilisé 2 amorces et 1 sonde taqman. il faut dire que c'est un stage qui date d'il ya 4 ans... il faut que je me remette dans le bain.
par contre je pense que tu fais une confusion (il me semble) il ya 2 techniques bien différentes : le taqman qui utilise un seule sonde qui porte le quencher et le fluorochrome on l'appelle aussi sonde d'hydrolyse car elle et hydrolysée pendant l'élongation par la taq ; puis il ya la pcr qui utilise 2 sondes appelées d'hybridation l'une porte un fluorochrome donneur et l'autre un fluorochrome accepteur : quand elles sont cote à cote le donneur transmet son énergie d'exitation à l'accepteur qui émet de la fluorescence. et ma question est de savoir si ces 2 sondes sont également hydrolysées par la taq? car apparament d'apres ce que j'ai lu ce n'est pas le cas et je comprend pas pourquoi?

j'espère que ma question est plus claire

[invite4ff9937a]

Salut

Oui oui je ne t'ai parlais que de la méthode taq man avec une seul sonde qui porte le quencher et le fluorochrome. Je ne vois pas l'érreur mais on se comprend toujours mieux soi-même!!lol

Il y'a en effet la méthode FRET (fluorescence resonance energie transfert ) c'est la méthode que j'ai utilisé lors de mon propre stage!
Tu as en effet deux sondes qui s'hybrident l'une a coté de lautre, ses deux sondes portent chacune un fluorochrome dont le spectre d'émission de l'un se superpose au spectre d'acceptation de l'autre.
Les sondes ne sont pas hydrolysées d'aprés ce que l'on m'a expliqué les sondes s'hybrident en même temps que les primers (étape de lecture de la fluorecence) puis lors de la polymérisation la température augmente ce qui permet aux sondes de se deshybrider ( c'est étudié pour!!!lol)...les primers ne se deshybrident pas car la polymérisation les a stabilisés!

J'éspére encore une fois mettre bien exprimé et surtout t'avoir aidé

marc

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite4248bdeb]

bonjour MARC,
j' aimerai MARC que vous me donniez le protocole de RT PCR quantitative. Merci.

[piwi]

Bonjours.
La discussion à plus d'un an. Je ne suis pas certain que desmarc revienne dessus aussitôt que vous le souhaitiez.
Maintenant pour les protocoles de qPCR, il n'en existe pas un. La qPCR est un méthode qui s'adapte aux procédures que vous souhaitez mettre en place. Préparation des cDNA, calibration, réalisation, analyse. Si vous n'êtes pas plus précis(e) dans votre demande, personne ne pourra vous aider.

Cordialement,
piwi

[invite4248bdeb]

Merci PIWI.

d' apres votre experience proffessinelle, j' aimerai azvoir tous les conseils pour ne pas retomber dans les erreurs. et c est vraiment possible de m' envoyer votre protocole adopté par vous.c est vrai je suis debutante dans le domaine et j' aimerai avoir des collégues tres performants .

bien à vous