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PCR en temps réel



  1. #1
    billywill

    PCR en temps réel


    ------

    Bonjour

    Je travaille ds un labo de recherche de bio animale.

    Je vais être amené à utilisé la PCR en temps réel, ds un labo voisin.Je souhaiterai connaitre le cout d'une serie de manip, sur un appareil de chez Roche car je risque être bloqué au niveau finance.

    Merci

    -----

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  3. #2
    Annaick_R

    Re : PCR en temps réel

    Salut,

    le plus simple pour connaitre les coûts, ça ne serait pas d'aller discuter avec le labo en question ? Ils connaissent leur machine, les réactifs qui marchent et les prix. Ils sauront te conseiller sur les choix techniques à faire en fonction de ta problématique.

    Le coût de ta manip va évidemment dépendre du prix du réactif mais aussi du nombre de tes échantillons, des témoins, du nombre de réplicat (fait tes points au moins en double) et de la technique employée.
    Par exemple, les sondes nucléotidiques marquées (de type TaqMan, Scorpion, etc...) coûtent plus cher que l'agent intercalant (type SYBR-Green). En plus, l'agent intercallant est plus pratique si tu veux tester plusieurs gènes : tu utilises le même réactif pour tout le monde. Avec les sondes nucléotiques, tu es obligé d'en avoir une spécifique de chaque gène.

    A propos de spécificité, prends un grand soin pour choisir tes amorces. Si tu travailles sur un organisme entièrement séquencé, vérifie que le gène que tu étudies, n'appartient pas à une famille de gènes (très facile à tester en BLAST). Si c'est le cas, positionne tes amorces dans la partie la plus divergente (3' UTR) et arrange-toi pour que les 5 derniers nucléotides en 3' soient spécifiques.
    Attentions aux introns si ta gamme de référence est une série de dilution d'ADN génomique !

    Je connais pas les réactifs de chez Roche, ni leur machine. C'est de la PCR en capillaires, n'est-ce pas?
    Je travaillais avec une machine Applied Biosystem. Leur réactif sont chers, par contre ceux d'Eurogentec marchent aussi bien et leur prix sont beaucoup plus abordable.

    Pour tout plein de détail sur la technique, je te renvoie au topic "RT PCR quantitative" (tu as pensé à faire une recherche avec le mot "PCR" dans le forum Biologie ?)
    Citation Envoyé par Annaick_R
    PS: si tu veux jeter un coup d'oeil sur ma thèse, téléchargeable ici (site thèses-en-lignes ):

    http://tel.ccsd.cnrs.fr/docs/00/04/7...l-00007807.pdf

    en particulier les pages 128-133 du Matériel et méthodes et le 1er chapitre des résultats (p.37-66)

    Annaïck.

  4. #3
    straw3berry

    Re : PCR en temps réel

    Citation Envoyé par Annaick_R Voir le message
    Salut,

    le plus simple pour connaitre les coûts, ça ne serait pas d'aller discuter avec le labo en question ? Ils connaissent leur machine, les réactifs qui marchent et les prix. Ils sauront te conseiller sur les choix techniques à faire en fonction de ta problématique.

    Le coût de ta manip va évidemment dépendre du prix du réactif mais aussi du nombre de tes échantillons, des témoins, du nombre de réplicat (fait tes points au moins en double) et de la technique employée.
    Par exemple, les sondes nucléotidiques marquées (de type TaqMan, Scorpion, etc...) coûtent plus cher que l'agent intercalant (type SYBR-Green). En plus, l'agent intercallant est plus pratique si tu veux tester plusieurs gènes : tu utilises le même réactif pour tout le monde. Avec les sondes nucléotiques, tu es obligé d'en avoir une spécifique de chaque gène.

    A propos de spécificité, prends un grand soin pour choisir tes amorces. Si tu travailles sur un organisme entièrement séquencé, vérifie que le gène que tu étudies, n'appartient pas à une famille de gènes (très facile à tester en BLAST). Si c'est le cas, positionne tes amorces dans la partie la plus divergente (3' UTR) et arrange-toi pour que les 5 derniers nucléotides en 3' soient spécifiques.
    Attentions aux introns si ta gamme de référence est une série de dilution d'ADN génomique !

    Je connais pas les réactifs de chez Roche, ni leur machine. C'est de la PCR en capillaires, n'est-ce pas?
    Je travaillais avec une machine Applied Biosystem. Leur réactif sont chers, par contre ceux d'Eurogentec marchent aussi bien et leur prix sont beaucoup plus abordable.

    Pour tout plein de détail sur la technique, je te renvoie au topic "RT PCR quantitative" (tu as pensé à faire une recherche avec le mot "PCR" dans le forum Biologie ?)
    est ce qu'il ya un protocole qui permet de diminuer les dimères en QPCR sans changer les amorces?

  5. #4
    Akïn

    Re : PCR en temps réel

    Bonjour,

    Peronnellement, j'utilise SYBR Green. Le volume final est censé etre de 20microlitres mais nous avons fait pas mal de test a 10microlitres et ca marche tout aussi bien.

    Essai de voir ce que tu es censé utiliser au sein de ton laboratoire. Peut être auras tu moyen de diminuer ton volume final.

    Globalement, mes volume sont les suivants pour un echantillon :
    5.8 d'eau
    1.2 de MgCl2 (erf j'ai plus la concentration en tete ...)
    1 de 1a' (enzyme)
    1 de primer (mix de primer Forward et Reverse)
    1 d'echantillon

  6. #5
    Annaick_R

    Re : PCR en temps réel

    Bonjour,
    est ce qu'il ya un protocole qui permet de diminuer les dimères en QPCR sans changer les amorces?
    Ah, l'absence de dimère... c'est le nerf de la guerre !

    Pour avoir testé et utilisé plusieurs dizaines de couples d'amorces, je trouve beaucoup plus simple de changer d'amorces que d'essayer d'optimiser les conditions.
    Mais tu peux quand même essayer d'augmenter la concentration en Mg2+ pour augmenter la stringence du milieu.

    Quelle méthode suis-tu pour choisir tes amorces ? A la main ou avec des logiciels qui prédisent les structures secondaires et les sites d'hybridations potentiels ?

    Pourquoi tu préfères ne pas changer d'amorces ?

    Annaïck.

  7. A voir en vidéo sur Futura
  8. #6
    slamart

    Re : PCR en temps réel

    euh, je pense que tu fais une petite erreur Annaick sur la stringence de la PCR par l'augmentation du MgCl2. Si tu augmentes sa concentration, la PCR deviendra plus permissive aux réactions non spécifiques. Si tu veux augmenter la stringence de ta PCR pour diminuer les Dimères, il faut tester la diminution de la concentration en MgCl2, augementer la température d'hybridation de ta PCR, ajouter une sonde TaqMan et lui donner la concentration la plus faible possible pour ton système.
    En effet, les dimères peuvent être embetant pour une réaction, mais encore faut il savoir quelle est la quantité de dimère produit, sa taille approximative (estimation grossière par courbe de fusion) et voir si ta cible est en faible quantité ou pas. Si tout ceci n'est pas dommageable pour ta PCR, et si derrière tu colles une sonde TaqMan, il n'est pas utile forcément de trouver le couple d'amorces idéal... et tu pourrais garder celui ci.
    Bon courage en tout cas.

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