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Efficacité PCR temps réel



  1. #1
    TamponTE

    Efficacité PCR temps réel


    ------

    Bonjour,

    Une petite question à propos de la PCR temps réel, chimie Taqman.
    Que vous évoque une efficacité de PCR supérieur à 100% ?

    Lors de l'analyse de vos résultats avec le logiciel couplé à votre appareil, est-ce que vous fixez le seuil de détection dez CT manuellement? Si oui, "jusqu'ou" vous le faites varier?

    Merci

    -----

  2. Publicité
  3. #2
    jmbowie

    Re : Efficacité PCR temps réel

    Il faut faire super attention avec l'efficacité dans les PCR en temps réel, qui dépend fortement de la façon dont tu places ton Ct (et le calcul de l'efficacité diffère parfois selon les machines! Notamment celui de Stratagène). Il peut arriver que tu aies des "efficacités" de 103, 104% voir plus.

  4. #3
    Cococcinelle

    Re : Efficacité PCR temps réel

    Bonjour,

    Perso je fixe toujours le Ct manuellement, sinon ca donne n'importe quoi. Idealement, tu dois visualiser ton Ct sous forme de ligne sur le graph coupant les phases exponentielles d'amplification de tes produits. Cette ligne doit passee au milieu ou dans la moitie inferieure de ce graph (en log).
    je te mets un exemple en fichier joint. Tu dois essayer d'avoir une variation minime (<0.5) entre les Ct de tes repliques.
    Et sinon, quant a l'efficacite, j'estime que 100% +/- 5% est raisonnable. DOnc jusqu'a 105% je ne m'inquiete pas.
    Fichiers attachés Fichiers attachés

  5. #4
    TamponTE

    Re : Efficacité PCR temps réel

    Oui, c'est marrant cette histoire d'efficacité supérieur à 100%. J'ai vu ailleurs que l'efficacité devait se trouver entre 90% et 110% et qu'il est préférable pour calculer cette efficacité de prendre en compte les Ct compris entre 23 et 35.

    Donc pour vous c'est simplement une histoire de fixer le seuil de détermination du Ct, ou bien de non-linéarité de la réaction?
    Ou carrément il y a vraiment synthèse, à chaque nouveau cycle d'amplification, de plus de 2 fois la quantité d'ADN du cycle précédent?
    Par exemple dans un cycle, des polymérases vont se fixer sur les amorces et démarrer la synthèse d'ADN à la queue leu leu?

  6. #5
    dosios

    Efficacité PCR temps réel

    Bonjour,
    la question est comment calculer l'efficacité de la PCR en temps réel, (chimie Taqman) j'ai trouvé plusieurs formules mais je ne sait pas quelle est
    moi j'utilise la Q PCR pour la détermination de niveau de la méthylation de l'ADN pour un gène donnée,
    et pour l'efficacité des amorces je fait une gamme des dilutions au 1/25eme,donc est ce que ce juste de trouver une différence de Ct entre 4 et 5 cycles entre chaque 2 points (1/25 et 1/625 par exemple) ou svp comment faire

    Merci

  7. A voir en vidéo sur Futura

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