A quoi sert le co-transfert avec un vecteur de résistance à un antibiotique
Dans mon problème on veut etudier la localisation de recepteur sur des cellules.
On les co transfecte donc avec
- un vecteur de resistance a un antibiotique
- vecteur d'expression codant pour chaque different recepteur + l'ARNc de l'ARNm de ces recepteurs.
Dans mes preoblèmes je retrouve souvent ces vecteurs de resistances et je ne comprend pas leur role
Merci d'avance
Salut,
En fait, on fait une co-transfection car ton plasmide ou se situe ton cDNA ne contient surement pas de gène de résistance. Dans ce cas là, si tu veux sélectionner par la suite uniquement les cellules qui ont intégré le plasmide, il te faut pouvoir les sélectionner. C'est là qu'intervient le deuxième plasmide avec le gène de résistance. En fait, lorsque l'on fait une co-transfection, on considère que si le plasmide A entre dans la cellule, alors le plasmide B rentre aussi (en respectant un ratio équivalent).
La meilleure méthode est quand même d'avoir un gène de résistance dans le plasmide où tu as ton gène d'intérêt, ça te permet de minimiser le nombre de clones faux-positifs (uniquement résistant et sans gène d'intérêt).
A plus
C'est pour faire un transformant stable exprimant ton gène d'intérêt. L'idée est de transfecter avec un vecteur codant pour une protéine de resistance à un antibio. Ce vecteur va s'intégrer (évenement très rare), et les transformants (ayant intégré le vecteur de manière stable) seront resistants à une sélection à l'antibiotique.
Il arrive que le vecteur contenant l'ADNc (dans ton cas l'ADNc (pas ARNc, les vecteurs sont a ADN en majorité (sauf certains vecteurs viraux)) codant les recepteurs de ta cellule, sous le controle d'un promoteur fort, permettant une forte synthèse de l'ARNm correspondant) pour le gène d'intérêt ne comporte pas de gène de resistance à des antibio eucaryotes. Donc l'idée est de co transfecter les deux vecteurs, puis, dans les clones resistants (i.e. ayant intégré le vecteur de resistance), on va rechercher lesquels ont aussi intégré le vecteur contenant le cDNA. Dans ce cas, la probabilité d'intégration est encore plus faible (p²) (sur ce point je diffère de l'avis de fxmulder )!!
Pourquoi ne pas faire un stable qu'avec le vecteur codant les recepteurs et cultiver en dilution limite pour établir des clones à partir de cellules isolées ? sachant que la proba d'intégration est de moins de 1 sur 1 million, ce serait impossible de trouver rapidement un clone stable
J'ai pas trop compris IngDr où tu n'étais pas d'accord... Si tu utilises deux plasmides (1 résistance et 1 gène d'intérêt), si tu n'as pas de bol : des cellules peuvent avoir la résistance sans le gène d'intérêt (et là, tu vas galérer pour trouver des clones stables !!) ou alors le gène d'intérêt sans résistance (et là tes clones stables crèvent, car pas résistants).
Donc, utiliser un seul plasmide, tu augmentes tes chances d'intégrer ton gène de résistance et ton gène d'intérêt, et donc probablement passer moins de temps à trouver un clone stable.
Voilà ce avec quoi je ne suis pas d'accord ! La proba de co integration est encore plus faible que la proba de simple intégration.Envoyé par fxmulder
Sinon, oui bien sur le mieux c'est d'avoir la resistance sur le plasmide ...
