Répondre à la discussion
Affichage des résultats 1 à 11 sur 11

Nickel et congélation ...



  1. #1
    Zellus

    Nickel et congélation ...

    Bonsoir,

    J'ai hésité un moment avant de vous demander ça mais je me lance quand même. Au pire je pourrai mettre ça sur le compte de l'heure tardive.

    Donc voilà, j'ai purifié un peptide l'autre jour qui avait un tag 6His sur une colonne Ni-NTA. Au moment de l'élution, j'ai utilisé un tampon 8 M urée, 100 mM NaH2PO4, Tris-HCl 10 mM, pH 2. Avec un tel pH le NTA se protone et le nickel de ma colonne est tombé avec mon échantillon. Et j'ai mis mes échantillons à -20°C.
    Le lendemain, lorsque je suis allé voir mes tubes, tous étaient congelés (normal à -20°C) sauf ceux de l'élution. Ou plutôt, sur mes 10 tubes correspondant à l'élution seul le dernier était congelé. De là, je me suis dit que le fait que les 9 autres tubes soient encore liquides ne venait pas du fait qu'ils soient à pH 2 (vu que le dernier est aussi à pH 2), mais sans doute que tout le nickel est tombé avant le 10 ème tube ...

    Je sais pas si je suis clair jusqu'à présent. Mais ma question est donc, même si elle peut paraître bizarre, le nickel a-t-il la possibilité de protéger contre la congélation un peu comme le glycérol (rrroo ça m'énerve jme souviens plus comment on appelle ça déjà ) ?

    Autres questions tant que j'y suis : Est-ce que c'est déjà arrivé à quelqu'un d'autre ici ? Et d'autres métaux que le nickel ont-ils aussi cette propriété si c'est bien de là que ça vient ?

    Merci d'avance.

    -----


  2. Publicité
  3. #2
    Morphine

    Re : Nickel et congélation ...

    Bonjour,

    pourrais tu m'expliquer pourquoi tu as besoin d'être en condition dénaturante pour éluer sur un colonne de Nickel?
    Pourquoi ne pas faire un gradient d'imidazole?
    C'a éviterait de se trainer le nickel... à moins que tiennes à le conserver?
    De même, je ne suis pas super convaincus de la nécessité d'être à un pH si acide... et encore moins avec un tampon Tris, dont le pKa est basique,si je ne m'abuse.
    J'ai pas trop compris non plus pourquoi tu as aussi un tampon phosphate... dont le pKa doit être autour de 7.

    Mais j'ai peut etre pâs bien saisis ce que tu fais/veux faire...
    J'aimerais bien, par curiosité, que tu m'expliques d'avantage ton protocole de purif', car c'a ne ressemble à rien que j'ai déja vu ou utilisé. (mais je débute ma carrièr faut dire:P)


    Morphine

  4. #3
    Zellus

    Re : Nickel et congélation ...

    Salut,

    Merci à toi d'avoir répondu .
    En fait, j'ai trouvé un protocole de purification dans un article et j'ai essayé de le reproduire. Le plus simple est que je le mette en entier :
    • lyse des bactéries dans 8 M urée, 100 mM NaH2PO4, Tris-HCl 10 mM, pH 8 (que j'appellerai Tp pour la suite) puis centri
    • dépôt sur colonne de Ni-NTA équilibrée avec Tp
    • lavage avec 2 cv (= volume de colonne) de Tp
    • 2 cv de Tp + 10 mM imidazole
    • 2 cv de Tp + 20 mM imidazole
    • 2 cv de Tp + 50 mM imidazole
    • lavage avec 5 cv de 200 mM KCl, 20 mM Tris-HCl, 1 mM βME, pH 7,5
    • digestion la nuit à température ambiante avec de la TEV
    • lavage avec 5 cv de 200 mM KCl, 20 mM Tris-HCl, 1 mM βME, pH 7,5
    • lavage avec 3 cv de Tp
    • élution avec 2 cv de Tp à ph 2
    Je travaille sur un peptide qui forme des fibres. Il est donc nécessaire d'avoir des conditions dénaturantes pour qu'il reste monomérique pendant la purification.
    Le gradient d'imidazole a permis de se débarasser des protéines "non spécifiques".
    Et le pH 2 est utilisé aussi pour dissocier les agrégats qu'aurait formés ma protéine...

  5. #4
    Morphine

    Re : Nickel et congélation ...

    Bonjour,
    merci pour ta réponse!

    Je comprend beaucoup mieux ce que tu fais maintenant!
    Tu es donc bien à un pH alcalin au début et tu fais un gradient de imidazol. C'a du sens.
    Quelle taille fais ton peptide?
    Je me demandais si tu avais déja essayé de le produire sans tag sous forme de corps d'inclusions. Il suffirait alors juste d'effectuer une renaturation dans l'urée. La formation de corps d'inclusions est souvent assez spécifique pour permettre d'être assez pure, sans avoir besoin d'avoir recours à un tag (je purifife moi même une protéine comme celà).
    Arrive tu à être pure avec ce protocoleou traines tu encore des contaminants?
    Je me demandais si le fait de travailler en urée, donc de déplier l'ensemble des protéines, ne risquait il pas d'augmenter les contaminants que l'on accroche sur colonne de Nickel en permettant à différentes protéines ayant des histidine enfouits de s'accrocher.

    Désolé de t'embêter et d'avoir fais dériver le sujet.... dont je ne connais aucunement la réponse, malgré de brêves recherches sur le net.

    Morphine

  6. #5
    Zellus

    Re : Nickel et congélation ...

    Salut,

    Quelle taille fais ton peptide?
    42 acides aminés soit un peu moins de 5 kDa.

    Je me demandais si tu avais déja essayé de le produire sans tag sous forme de corps d'inclusions. Il suffirait alors juste d'effectuer une renaturation dans l'urée. La formation de corps d'inclusions est souvent assez spécifique pour permettre d'être assez pure, sans avoir besoin d'avoir recours à un tag (je purifife moi même une protéine comme celà).
    Ce peptide forme des corps d'inclusion justement d'où l'utilisation d'urée aussi pour les récupérer. En fait j'ai testé plusieurs choses et il faut que je recoupe tout ça. J'avais testé avec de la guanidine aussi mais là je retrouve mon peptide dans le culot après la lyse des bactéries.
    J'ai toujours fait avec le tag pour qu'il soit le plus pur possible. J'ai pas encore fini la purif comme dans l'article en fait parce qu'après je dois faire une dialyse puis une pphase inverse. Mais bon, là c'est vacances !!

    Arrive tu à être pure avec ce protocoleou traines tu encore des contaminants?
    Vois par toi-même sur mon gel. C'est la grosse bande dans le bas du troisième puits juste avant le marqueur de taille.

    Je me demandais si le fait de travailler en urée, donc de déplier l'ensemble des protéines, ne risquait il pas d'augmenter les contaminants que l'on accroche sur colonne de Nickel en permettant à différentes protéines ayant des histidine enfouits de s'accrocher.
    Tu as sans doute raison, parce que quand j'ai fait un western blot avec un anticorps anti-His, j'ai obtenu pusieurs bandes. Mais bon aucune n'égalait la patate de mon peptide.

    Désolé de t'embêter et d'avoir fais dériver le sujet.... dont je ne connais aucunement la réponse, malgré de brêves recherches sur le net.
    Pas de problème . Mais ça va continuer à m'intriguer longtemps cette histoire ...
    Je devrais peut-être aller demander en chimie voire physique ...
    Images attachées Images attachées

  7. A voir en vidéo sur Futura
  8. #6
    Morphine

    Re : Nickel et congélation ...

    Ok,

    c'est vraiment petit comment "objet".
    Je me demande si, justement, tu ne pourrais pas profiter que ton objet soit si "petit" pour finir par une étape de gel filtration au lieu d'une phase inverse.

    J'espère que ton protocole fonctionnera bien ceci_dit.

    Sinon, plutot que d'éviter à tout pris que ta protéine ne s'agrège.... pourquoi ne pas utiliser cette caractéristique comme moyen de purification?
    C'est la stratégie que j'aurais employer avec une protéine dont l'agréation est obligatoire.
    Mais je ne garantie pas que c'a aurait mieux fonctionner.

    Bon courage cependant.

    Morphne

  9. Publicité
  10. #7
    Zellus

    Re : Nickel et congélation ...

    c'est vraiment petit comment "objet".
    Et oui c'est le plaisir qu'on a avec les peptides.
    Et encore, la grosse bande que tu vois correspond à mon peptide encore taggé (mon clivage a mal marché). Dessous tu peux voir une faible bande qui correspond bien à mon peptide sans tag.

    Je me demande si, justement, tu ne pourrais pas profiter que ton objet soit si "petit" pour finir par une étape de gel filtration au lieu d'une phase inverse.
    C'est clair qu'il serait facile de le séparer par gel filtration, mais le problème c'est que tu ne peux pas charger un grand volume sur la colonne et ça dilue généralement ta protéine ... Et surtout mon chef est pas très motivé pour ... Si j'avais la possibilité je testerais plein de trucs lol.

    Sinon, plutot que d'éviter à tout pris que ta protéine ne s'agrège.... pourquoi ne pas utiliser cette caractéristique comme moyen de purification?
    C'est la stratégie que j'aurais employer avec une protéine dont l'agréation est obligatoire.
    Je garde ça en tête.
    Tu pensais à quoi exactement comme manip ?

    Bon courage cependant.
    Merci !!

    PS : Si tu as un protocole de purif de corps d'inclusion je suis preneur ^^.

  11. #8
    yytreza

    Re : Nickel et congélation ...

    Bonjour j'ai un problème différent, comme je vois que vous aimez travailler dans l'urgence, j'ai un rapport de stage à finir pour ce soir. Rassurez vous j'ai presque fini (quand même) mais j'ai réaliser mon stage en juin et j'ai oublié pas mal de chose depuis. Heureusement que j'avais tout noter...ou presque...et oui mon problème se situe là... Je vais pas vous faire attendre plus longtemps j'aurai besoin d'un protocole de surproduction de protéine et de purification, ma prot fait dans les 15Kda et je l'avais fait par colonne de nickel.

    d'avance merci ^^

  12. #9
    vpharmaco

    Re : Nickel et congélation ...

    Bonjour, question toute bête,

    Est ce que tu as déjà regardé si le tampon utilisé congèle à moins 20°C. Je dis ça car une solution glace+NaCl permet de baisser le point de fusion de l'eau alors avec 8M urée !!! il est possible que le tampon ne congèle pas.
    Je veux bien que tu nous tiennesau courant si tu as la réponse.
    Autre remarque histoire de prêcher un peu pour ma paroisse : est ce que tu as envisager d'obtenir ton peptide par SPPS. on arrive maintenant à produire des peptides assez longs et parfois tres aggregants (b-amyloide) avec des rendements corrects et ue tres bonne pureté.

    A+

  13. #10
    Zellus

    Re : Nickel et congélation ...

    Bonsoir,

    Citation Envoyé par yytreza
    Je vais pas vous faire attendre plus longtemps j'aurai besoin d'un protocole de surproduction de protéine et de purification, ma prot fait dans les 15Kda et je l'avais fait par colonne de nickel.
    Il y a beaucoup de protocoles possibles. Ca dépend surtout de ta protéine, sa stabilité ...
    Mais si tu veux un exemple (je fais pas de phrases hein, la flemme ) :
    Pour la production (culture de 4 litres par exemple) :
    1. culture des bactéries (transformées avec le plasmide codant pour ta protéine) à 37°C jusqu'à A600 = 0,8
    2. induction avec IPTG 2h à 37°C (ou 28°C ou autre suivant la stabilité de ta prot)
    3. centri 10 minutes à 4500 rpm
    4. resuspension culot dans tampon (par exemple Tris-HCl pH 7,5 20 mM, KCl 200 mM, 2-mercaptoéthanol 1 mM)
    5. lyse par sonication
    6. centri 30 min à 18000 rpm
    Pour la purif :
    1. chargement de ton surnageant sur la colonne de Ni2+ (équilibrée avant avec le même tampon que précédemment ; d'ailleurs tu peux aussi ajouter de l'imidazole à 20 ou 30 mM pour augmenter la spécificité de fixation sur la colonne)
    2. lavage de la colonne avec le même tampon
    3. élution avec un gradient d'imidazole jusqu'à 500 mM par exemple (dans le même tampon que tout à l'heure)
    Après tu peux dialyser ta protéine pour virer l'imidazole, tu peux la concentrer si elle ne l'est pas assez par ultrafiltration par exemple ...
    Bref, plein de choses possibles !
    Bon courage pour ton rapport !

  14. #11
    Zellus

    Re : Nickel et congélation ...

    Salut,

    Citation Envoyé par vpharmaco
    Est ce que tu as déjà regardé si le tampon utilisé congèle à moins 20°C. Je dis ça car une solution glace+NaCl permet de baisser le point de fusion de l'eau alors avec 8M urée !!! il est possible que le tampon ne congèle pas.
    Je veux bien que tu nous tiennesau courant si tu as la réponse.
    Oui, il n'y a aucun problème de congélation pour mes échantillons ne contenant pas de nickel. Ceux qui en contiennent ont congelé depuis le temps quand même, et depuis j'ai refais des purif mais je les mets directement à -80°C, et là, le nickel fait plus son malin . Tu connaîtrais le point de congélation de l'urée stp ?

    Citation Envoyé par vpharmaco
    Autre remarque histoire de prêcher un peu pour ma paroisse : est ce que tu as envisager d'obtenir ton peptide par SPPS. on arrive maintenant à produire des peptides assez longs et parfois tres aggregants (b-amyloide) avec des rendements corrects et ue tres bonne pureté.
    Justement ce peptide en question est le peptide bêta-amyloïde de la maladie d'Alzheimer lol. Nous n'avons pas le matériel pour faire de la synthèse en phase solide. Le but est justement de le produire nous-mêmes pour ne pas avoir à l'acheter. Tant qu'à faire !

Sur le même thème :

Discussions similaires

  1. [Biologie Cellulaire] Effets de la congélation
    Par Alekcyas dans le forum Biologie
    Réponses: 19
    Dernier message: 15/11/2014, 07h10
  2. Congelation
    Par aqualover001 dans le forum Physique
    Réponses: 0
    Dernier message: 06/03/2008, 17h17
  3. [Microbiologie] congélation/décongélation !
    Par bibi25 dans le forum Biologie
    Réponses: 0
    Dernier message: 11/01/2008, 12h16
  4. Vitesse de congélation ?
    Par cnico2004 dans le forum Chimie
    Réponses: 5
    Dernier message: 23/11/2007, 14h29
  5. [Blanc] congélation
    Par lestat92511 dans le forum Dépannage
    Réponses: 2
    Dernier message: 12/09/2007, 19h13