Vecteur d'expression transitoire
Bonjour à tous,
un vecteur d'expression sans séquence ORI peut il avoir une expression transitoire ?
Il me semble que non, car tant qu'il n'a pas intégré le genome de la cellule hôte, comment pourrait-il initier sa transcription sans séquence ORI ?
Apparemment il peut, mais je vois pas comment en fait...
Oui il y a expression de ton plasmide sans séquence Ori car cette séquence est nécessaire pour la réplication du plasmide et c'est une origine de réplication procaryote lorsqu'on fait des expressions transitoires car on produit les plasmides chez E. coli. Pour initier la transcription on utilise la plupart du temps le promoteur fort du cytomégalovirus (CMV) que l'on place en amont de la séquence codante.
Greg
Merci Greg !
Et oui pas bête, séquence ORI pour la réplication et pas la transcription.
Donc dans notre vecteur d'expression, on met :
- un promoteur (compatible avec la cellule hôte)
- la partie codante du gène
- un signal poly A
Mais comment va se faire l'expression en fait ? Des facteurs de transcription vont reconnaître le promoteur et l'activer, entrainant l'arrivée de l'ARN polymérase (comme un gène normal) ?
Dans le cas du promoteur fort CMV, je ne pense pas que ce soit des facteurs de transcription spécifique qui se fixe à sa séquence mais tout simplement les facteurs généraux de transcription. C'est juste que la force du promoteur est bonne : le complexe de transcription est rapidement associé au promoteur et positionné, et l'étape d'initiation se fait elle aussi rapidement, ce qui permet à la RNA polymérase II de rapidement libérer le promoteur pour qu'une autre RNA polymérase II vienne se positionner à son tour. Ce promoteur est d'origine virale et le virus en question infecte des cellules eucaryotes, il est donc adapté à la machinerie de transcription eucaryote.
Tout à fait, c'est ce qu'il faut mettre dans ton vecteur d'expression, et tu peux rajouter aussi entre la séquence codante et le signal de polyadénylation une séquence intronique. Habituellement on utilise celle du virus SV40. L'épissage du pré-ARNm favorise l'export de l'ARNm qui fait partie des régulations de l'expression génique eucaryote, et donc là tu favorise encore une production massive de ta protéine.
Et dernière chose, pour la production des plasmides dans des bactéries, il ne faut pas qu'une origine de réplication procaryote (Ori) mais aussi des séquence codant un ou plusieurs gènes de résistance à des antibiotiques (habituellement 2) pour sélectionner les bactéries qui ont intégré le plasmide dans un milieu de culture contenant les antibiotiques.
Te voilà paré au combat!
Greg
