Vecteur de clonage, PCR et vecteur d'expression

[inviteb853f23b]

Bonjour!
J'ai un petit problème pouvez-vous m'aider?Je suis en train de lire un article scientifique et je ne comprends pas tout.
Voilà, peux t-on faire une PCR sur un vecteur de clonage comportant le gène d'intérêt? c'est pour le clonage d'une enzyme. Ils parlent de "strands" (anglais) de plasmides qui ont été amplifiés par PCR dans un premier temps mais je ne sais pas si c'est possible directement sur un vecteur de clonage? Le gène d'intérêt est lié au gène GST (gluthation transférase). Ils disent ensuite que le produit de PCR (?) est purifié par électrophorèse sur gel d'agarose et ensuite il est encore inséré dans un autre vecteur "entry vector" en utilisant une deuxième PCR(???). Puis ils utilisent enfin un vecteur d'expression pour obtenir la protéine de fusion GST-gene d'intérêt.

Je ne comprends pas. Quelqu'un pourrait m'expliquer?
Merci a plus
-----

[Yoyo]

salut

C'est assez simple en fait. Le gene d'interet etait deja present sur un plasmide mais qui ne leur convenait pas. Ils ont donc amplifié le gene par PCR, on purifier le produit d'amplification sur gel pour se debarasser du plasmid ayant servi de matrice, pour cloner le tout dans un plasmide permettant l'expression de la protéine. Sans doute dans un but de la purifier vue qu'elle est fusionnée a la GST.

YOyo

[invite0a985bc8]

Il peuve aussi utiliser la gst pour des experiences de double hybride histoire de confirmer l'expression

[Vinc]

Salut!

Il peuve aussi utiliser la gst pour des experiences de double hybride histoire de confirmer l'expression

Qu'est ce que le double hybride a à voir la dedans??? Le Y2H n'est pas du tout destiné à vérifier l'expression d'une protéine...

A+
Vinc

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite0a985bc8]

En utilisant un gene rapporteur et le substrat de l'enzyme pour savoir si elle est bien presente

[Yoyo]

Salut

Je pense Nhyma que tu as une fausse notion du double hybride car il ne sert pas a verifier la presence d'une enzyme, et n'a rien a voir avec le substrat de l'enzyme.

Yoyo

[invite0a985bc8]

? Je ne voulais pas dire que c'etait specifique d'une enzyme mais qu'on pouvait utiliser l'enzyme comme proteine liée au DB et le substrat lié au AD

[Yoyo]

Salut

Je pense surtout que tu utilises le mauvait vocabulaire. un substrat est une petite molecule qui est modifiée par l'enzyme. dans quelques cas le substrat peut etre une autre proteine, mais on n'utilise pas le double hybride pour etudier cela.

Le double hybride sert a determiner si deux proteines peuvent interagir, ni plus ni moins.

Yoyo

[Vinc]

Et j'ajouterai que les substrats des enzymes ne sont pas toujours des protéines (c'est même très fréquent, pour ne pas dire le cas général) : pas évident de faire du double-hybride avec du glucose en proie ou en appat

Vinc

[invite0a985bc8]

Ouaip justement , l'enzyme interagit avec son substrat . Il me semble que le probleme posé est sur le clonage de l'enzyme . POur savoir si l'enzyme a parfaitement ete cloné on prend l'extrait que l'on a obtenu suite aux experiences de PCR pratiquées et on pratique un double hybride avec cet extrait couplé au Db et le substrat couplé au AD . Si l'enzyme a ete clonnée parfaitement les deux proteines vont interagir et on pourra voir la trascription du géne reporteur . A l'inverse si elle n'a pas ete bien clonnée elle n'interagira pas bien avec son substrat et pas de transcription du gene reporter.

[Vinc]

Non parce que le plasmide dans lequel tu vas cloner ton enzyme ne sera pas le même que celui que tu vas utiliser pour faire du double hybride donc ça ne sert à rien car:
1. il faut changer de plasmide, refaire un clonage en faisant une fusion avec AD ou BD et donc re introduire des erreurs potentielles indépendantes du premier clonage.
2. on utilise rarement la séquence entière lorsque l'on fait du double hybride et l'on préfère fragmenter les protéines proies et appat en plusieurs domaines que l'on testera chacun à leur tour!

Donc conclusion : ça ne sert strictement à rien de faire du double hybride (très compliqué qui demande beaucoup de mise au point, etc...) pour vérifier un simple clonage (qui se vérifie très rapidement par séquençage)! C'est un peu comme jouer du piano avec des gants de boxe : c'est beaucoup plus compliqué car pas prévu à cet effet...

Vinc

[invite0a985bc8]

Ah ok cette reponse me va deja mieux ^^ mais c'etait le principe qui m'interessait + mais c'etait pour essayere de voir si on pouvait faire le double hybride "" a l'envers ""

[inviteb853f23b]

oui, mais s'il se débarasse du plasmide ils auraient du utiliser des enzymes de restriction??alors que la dans l'article il ne l'utilise pas.

[Yoyo]

Grace a la PCR ils n'ont pas besoin d'enzyme de restriction pour sortir le gene d'interet du plasmide donneur. La seule etape ou elles sont necessaires c'est pour ouvrir le vecteur receveur.

YOyo

[inviteb853f23b]

OK! Merci beaucoup de ta réponse !! Ca m' a été d'une grande aide
A plus