PCR et vecteur de clonage

[invite36e7410e]

Bonjour à tous!
je fais un stage de recherche en génétique et aujourd'hui j'ai commencé mon rapport de stage... seulement voilà, je me pose une question et je suis sûre que l'un d'entre vous pourra y répondre :
PCR et vecteur de clonage sont deux technique qui permettent d'amplifier un gène d'intérêt et je sais que l'amplification par PCR est de l'ordre d'un million de copies en quelques heures mais quel est l'ordre de grandeur pour le vecteur de clonage (inséré dans une bactérie E.coli BL21)?
merci d'avance pour vos réponses!
Aurélie
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[invite0ad4995a]

seuls les personnes qui ont acces a ces experimentations peuvent te renseigner je pense. De plus si la donnee est encore inconnue alors tu feras avancer la science...Neanmoins si le PCR est plus utilise aujourd'hui c'est que l'utilisation de vecteur est encore moins efficace donc...bonne chance

[invite972494a2]

Une colonie bactérienne sur gélose correspond à peu près à 10⁹ bactéries en 24h. Selon les cas tu peux avoir une ou plusieurs copies du plasmide par bactérie.

[invitec9f0f895]

Bonsoir,

La PCR permets d'amplifier un fragment d'ADN. ceci permet principalement d'obtenir une quantité de ce fragment suffisante pour etre travaillable/analysable.
Les vecteurs de clonage permettent d'obtenir un vecteur (plasmide, phagemide, cosmide etc...) quand on parle d'amplification de l'ADN, c'est alors que tu as une molécule qui va se répliquer dans la bacterie (comme les chromosomes) ceci va permettre d'obtenir un grand nombre de copie du plasmide.

Ce sont deux amplifications qui sont totalement différentes et qui n'ont pas du tout les meme objectifs. Il est important, voir essentiel de bien en comprendre les différences.

Yoyo

[A voir en vidéo sur Futura]

[invitea0443c8c]

Salut!
Pour prendre un exemple relatif à ce qu'a expliqué Yoyo, si par exemple tu veux qu'une bactérie exprime une protéine A codée par le gène A exogène a la bactérie bien sûr, tu vas dans un premier temps faire une PCR (en utilisant des primers spécifiques) à partir du génome d'un organisme exprimant ce gène A.
Cette première étape te permet d'obtenir le gène A en grande quantité, ce qui est essentiel pour pouvoir travailler dessus par la suite.

Tu peux ensuite faire une ligation de ce gène A, obtenu par PCR, dans un plasmide (ou un autre vecteur) que tu vas transférer dans une bactérie (c'est toujours un exemple...).
La bactérie pour se multiplier va répliquer son génome et le plasmide contenant le gène A. Au final tu obtients donc un plasmide d'expression, en grande quantité, et contenant le gène d'intérêt. Tu peux également récupérer la protéine A (synthètisée par la bactérie car codée par le gène A) dans ton milieu de culture.
La PCR permet uniquement d'avoir suffisamment de matériel biologique pour faire tes contructions par la suite...
A+
Vinc

[invitec6dfc6b7]

y'a pas aussi une histoire où avec la PCR, il est nécessaire de connaitre la séquence, tandis qu'avec le clonage, il est pas nécessaire justement de la connaitre... seulement, faut avoir des gènes de reconnaissances ( c'est dingue, j'ai déjà oublié le nom exact...! ca promet!! ), et puis, je pense que la quantité produite n'est pas la même...

[invitea0443c8c]

Salut!

y'a pas aussi une histoire où avec la PCR, il est nécessaire de connaitre la séquence

Ok..........bon, il y a plusieurs techniques de PCR différentes et certaines astuces peuvent être utilisées pour, par exemple, palier à la méconaissance de la séquence à amplifier.
Mais tu dois de toute façon connaître un minimum la séquence que tu veux amplifier de manière à pouvoir élaborer tes primers (=amorçes qui vont encadrer la séquence à amplifier sur chacun des 2 brins). Dans le cas d'espèces peu connues génomiquement parlant, tu peux utiliser une sauce d'amorçes dégénérées qui va être un mélange de primers permettant une hybridation plus ou moins efficace avec ta séquence cible (c'est très simple à comprendre avec un shèmas!).
Tu peux également utiliser la RACE PCR si tu connais le milieu d'une séquence mais que tu veux savoir ce qu'il y a aux extrémités.....
D'autres améliorations peuvent encore augmenter l'éfficacité de ta PCR ou permettre son utilisation de manière un peu inhabituelle (mutagénèse dirigée par PCR).
A+
Vinc

[invite36e7410e]

Merci beaucoup à tous pour vos réponses... j'ai bien compris qu'il y a une grande différence entre les 2...en fait je ne devrais pas les comparer en terme d'amplification mais comme je suis tétue est ce que je peux estimer que la PCR amplifie de l'ordre de 10.6 et le clonage 10.9 comme quelqu'un me l'a dis?

[invite36e7410e]

euh non pas 10.9 beaucoup plus puisque c'est seulement pour une colonie alors que j'en ai une 50a sur une boite et que je les remet en culture...

[invite94612525]

Merci beaucoup à tous pour vos réponses... j'ai bien compris qu'il y a une grande différence entre les 2...en fait je ne devrais pas les comparer en terme d'amplification mais comme je suis tétue est ce que je peux estimer que la PCR amplifie de l'ordre de 10.6 et le clonage 10.9 comme quelqu'un me l'a dis?

Tu peux etre tetue tout en etant logique.
Explique donc comment tu obtiens ses valeurs, on verra alors si tu as compris (pour la PCR, tu dois pouvoir faire un calcul simple en fonction du nombre de cycle)...

[invite6e00ad7f]

Salut,

pour la PCR il y a une amplification exponentielle.
En ce qui concerne le clonage, est-ce que l'on peut vraiment déterminer l'ordre d'amplification puisque l'insert n'est pas forcément incorporé dans le bon sens et qu'il risque également d'y avoir des réactions intramoléculaires des extrémités du vecteur de clonage?
Comment estimer toutes ces possibilités?

[invitec9f0f895]

>delirium

Non quand tu amplifies un vecteur par transfo, tu ne le fait qu'a partir d'une molécule que tu sais etre la bonne (ou que tu verifies a posteriori).
Donc il doit etre possible de calculer l'amplification en aprtant du postulat (faux) qu'une seule molecule transforme une bacterie. tu connais le nombre de plasmide par cellule, et le nombre de cellules dans une culture de 5ml alors cela te donne un nombre de molecules.

Yoyo

[invite36e7410e]

bon ok je vais essayer de trouver toutes les infos dont j'ai besoin pour mes calculs et quand j'ai les résultats je vous les transmet (si ça m'intéresse ça interressera peut être d'autre personnes aussi !)

[invitee8702407]

Je connais la PCR comme méthode d'amplification, mais j'ai aussi entendu parler de la PCR comme méthode de vérification (utilisée après sélection de bactéries sur antibiotique).

En quoi une PCR peut-elle vérifier quelque chose?

[invitee863e61a]

Je connais la PCR comme méthode d'amplification, mais j'ai aussi entendu parler de la PCR comme méthode de vérification (utilisée après sélection de bactéries sur antibiotique).

En quoi une PCR peut-elle vérifier quelque chose?

Tu peux faire une PCR avec des amorces spécifiques d'une séquence pour en vérifier la présence dans un ADN donné. Par exemple à la suite d'un clonage, après sélection des transformants sur antibotiques/marqueur, avec des amorces spécifiques à l'insert, tu peux rechercher les transformants dont le vecteur a intégré l'insert d'intérêt. Le mieux c'est même de prendre une amorce dans le vecteur, l'autre dans l'insert pour vérifier que ce dernier est au bon site.

[invitee8702407]

D'accord... merci jmbowie.

Pour faire cette PCR il faut d'abord sortir le plasmide de la bactérie non?

Et puis je me demande quel est vraiment l'intérêt de cette méthode?
L'insert, s'il est présent, va être multiplié mais on en a pas l'utilité vu que les bactéries ont déjà du faire ce travail Ne serait-il pas plus simple de digérer le plasmide dans les enzymes de restriction spécifiques de l'insert, et de vérifier si l'insert est présent en faisant une électrophorèse?

[piwi]

vous shuntez la moitié de la méthode.
Ce que vous avez au départ ce sont des colonies isolées portant ou non l'insert. C'est ce que vous voulez vérifier.
Pour cela ce que vous faites c'est prendre une boite de culture neuve et des cures dents.
Vous piquez une colonie, vous trempez le cure dent dans le tube PCR qui contient deja le mix puis piquez la boite propre de manière à pouvoir retrouver vos colonies en fonction de la PCR.
Pour la PCR vous commencez par une phase à 94° durant disons 10-15 minutes ce qui a pour effet de lyser les bactéries et de libérer le plasmide (j'ai déjà essayé 3 minutes, ça fonctionne mais la lyse n'est pas optimale et on a pas de résultat pour toutes les colonies.)

La PCR sert de vérification et la boite propre sera votre stock pour faire pousser uniquement les colonies que vous aurez sélectionnées.

Vous devez être bien conscient que quelques bactéries au bout d'un cure dent ne sont pas suffisantes pour faire directement des restrictions. Si vous choisissez cette option vous devrez en passer par une phase de miniprep bien plus fastidieuse qu'une PCR.

Cordialement,
piwi

[invitee8702407]

D'accord!!! Merci piwi pour la clarté de ta réponse!