PCR et clonage
bonjours,j'ai une question pour vous...
on veut cloner une séquence dans un plasmide (pGEM3) coupé par 2 enzymes de restriction (enzymes utilisés pour linéariser pGEM3).mais aucun des sites qui entourent la séquence à cloner n'existe dans le site de clonage de PGEM3.
alor peut on, en utilisant la pcr, contourner ce probleme?
merci
Salut,
oui on peut.
oui,mais comment fait on?
merci..
Salut
tu as deux possibilités selon les cas.
1- soit tu mets des sites de clonages en 5' dans tes oligos qui vont te permettre d'amplifier le fragment par PCR. Ensuite tu digeres le produit de PCR avec ces enzymes et tu le ligue dans ton vecteur coupé par les enzymes compatibles.
2- tu ouvres ton plasmide, soit avec une enzyme qui coupe franc, ou alors cohésive (et tu rempli le site avec la Klenow). puis tu clones directement le produit de PCR (qui est bout franc si tu as utilisé une enzyme fidele).
Yoyo
merci bp!
j'ai une deuxième question qui concerne la pcr..
ds une cellule normale,les 2 gènes bcr et abl st sur des chromosomes différents ( 9 et 22).en cas de translocation bcr/abl,impliqué dans certaines leucémies,les 2 gènes se trouvent placés en contiguité sur le chromosome résultant de la translocation.comment une pcr effectué avec une amorce sur le gène abl et une autre sur le gène bcr,permet de poser le diagnostic de translocation?
merci
Il y a une troisième possibilité, c'est ce que je suis en train de faire en ce moment au labo d'ailleurs.
Tu linéarises ton plasmide avec un site de restriction qui n'est pas dans ton insert.
Tu fais une PCR pour amplifier ton insert. Tes oligos sont alors des 40mer avec 20 bases de l'extremité 5' du plasmide et les 20 bases en 5' de l'insert. En 3' tu prends le complémentaire de 20 bases en 3' de l'insert et 20 bases de l'extremité 3' de l'insert.
Ensuite tu clones en mettant ton plasmide linéarisé et ta PCR.
Le plasmide peut intégrer l'insert par recombinaison homologue. Du coup, il se recircularise et est maintenu. La bactérie conserve la résistance conférée par le plasmide. Soit il se recircularise seul (c'est possible). Soit il reste ouvert, il est digéré et la bactérie meurt.
Tu séléctionnes donc rapidement tes plasmides recombinés en faisant des PCR sur tes clones.
Cordialement,
piwi
salut
pour ce qui est de la troisieme possibilite proposée par piwi en effet ca devrait marcher, bien que je ne sois pas tres optimiste sur l'efficacité. Autant que je sache coli fait relativement mal la recombinaison homologue, en plus ca te fait commander des oligos relativement long (au moins 40mers) avec les inconvenients que cela entraine (risque important d'erreurs dans les oligos). Ensuite je suis pas certain de l'avantage de cette strategie par rapport au clonage franc directe du produit de PCR... piwi tu pourrais expliciter les raisons qui font que tu as choisis une telle strategie plutot qu'un clonage plus "simple"?
Pour la deuxieme question, la reponse est evidente. si tes deux genes sont sur des chromosomes differents alors avec tes amorces tu n'amplifieras rien du tout. en revanche apres translocation les deux genes etant contigus tes amorces vont permettre l'amplification d'un fragment. Donc si tu as une PCR positive tu sais qu'il y a bien eut translocation.
Yoyo
merci à vous 2!c super
a+
