PCR et Taq : répétition de nucléotide

[invite79917c5c]

Bonjour,
Je fais de la zoologie moléculaire chez les murinae et le taxon praomys me pose problème.


J'ai remarqué que même si mes PCR fonctionnent correctement, derriere si je séquence (enfin j'envoie à une société de séquencage) mon gène ZP4 j'ai un electrophérogramme illisible à partir d'une certain niveau.
Et j'ai remarquer une enorme répétition de 'A' et 'C' (genre une dizaine) juste avant que l'electropherogramme devienne illisible. Cette répétition pose t'elle problème à la Taq pour le séquencage, et si oui pourquoi?

Merci

Cordialement, Allan
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[invite186e1b0b]

Salut!

J'ai peut être une idée, mais je dois avoir quelques précisions :

As tu refais la même manip (même condition, même origine du fragment amplifié) et eu le même problème? Si non, ben il faudrait recommencer.

Deplus :

tu fais quoi comme type de PCR ?
Quelle preuve as tu que ton amplification à bien marché?

Voilà...
Je pense que toute personne tentant de répondre à ta problème va te poser ces questions !

Amicalement :

Greg

[invite79917c5c]

Bonjour,

Je verifie ma PCR avec une electrophorèse sur Gel d'agarose et celle-ci a bien marchée (deux fois dans différentes conditions.) Si j'envoie à séquencer c'est forcément une PCR correcte mais c'est vrai que j'ai pas préciser

Je pense qu'il y a réellement une insertion dans le gène d'un poly A et que cela empèche un séquencage dans les meilleures conditions?

Cordialement, Allan

[invitee863e61a]

Bonjour,

Je verifie ma PCR avec une electrophorèse sur Gel d'agarose et celle-ci a bien marchée (deux fois dans différentes conditions.) Si j'envoie à séquencer c'est forcément une PCR correcte mais c'est vrai que j'ai pas préciser

Je pense qu'il y a réellement une insertion dans le gène d'un poly A et que cela empèche un séquencage dans les meilleures conditions?

Cordialement, Allan

Essaie avec une grosse quantité de produit à séquencer, ou en augmentant le nombre de cycles pendant la réaction de séquences.

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite17a570c1]

Salut,

Tu utilises la Taq classique? Si oui, pense plutôt à prendre une autre enzyme qui a un taux d'erreur un peu moins élevé Et surtout si tu soupçonnes des séquences un peu problématiques (%GC élevé, répétitions,...).

Dans quel but fais-tu les produits de PCR? Comment sont faites tes amorces pour le séquençage? Quand je fais les miennes, je prévois à ce qu'elles donnent des séquences qui se recouvrent sur les extrémités. Et ça marche bien


Cordialement,

[invite79917c5c]

J'utilise la taq Gold.

Mais un truc qui confirme quand même l'hypothèse d'une insertion réelle dans le gène d'un poly A c'est que je l'ai dans les deux sens du séquencage.
En plus je viens de remarquer que pour une autre espèce du même taxon (je travail sur les murinés) j'ai un poly A au même niveau, mais plus cours et le séquencage a bien marché.

Je pense donc qu'il faut que je designe une amorce en amont du supposé poly A pour pouvoir séquencer.

[invite79917c5c]

Salut,

Tu utilises la Taq classique? Si oui, pense plutôt à prendre une autre enzyme qui a un taux d'erreur un peu moins élevé Et surtout si tu soupçonnes des séquences un peu problématiques (%GC élevé, répétitions,...).

Dans quel but fais-tu les produits de PCR? Comment sont faites tes amorces pour le séquençage? Quand je fais les miennes, je prévois à ce qu'elles donnent des séquences qui se recouvrent sur les extrémités. Et ça marche bien


Cordialement,

Mes amorces sont choisie pour former des fragments contigus et chevauchant .
Le poly n'est pas dans une zone chevauchante

[piwi]

Bonjour,

Tu séquences en sens et en anti-sens? Comment lis tu tes séquences? D'après une séquence rendue par le programme de séquençage ou directement sur les pics avec un programme type bioedit? Je te demande parce que parfois les programmes des séquenceurs ne parviennent pas à lire une séquence sur les pics parce qu'ils sont trop faibles, un peu étalés, qu'il y a un bruit de fond, mais en les regardant toi même tu y arrives et tu complètes tes trous.

Cordialement,
piwi

[invite79917c5c]

Je séquence en sens et anti-sens oui.

Et j'utilise le logiciel sequencher mais mes Pics sont très bien même au moment du polyA c'est après que ça foire