bonjours à tous,
J'aurais 2 questions:
1/ Mon projet consiste à cloner des séquences de gènes impliqués dans la résistance aux métaux lourds,d'un champignons endémiques (non séquencés et annotés)!
après un gros travail de blastX et P sur plusieurs banques, j'ai pu obtenir des alignements inter espèces qui mettent en lumière des zones relativement conservées.. A partir de ses alignements je dois designer des amorces dégénérées afin d'amplifier des séquences de mon espèces endémique pour les séquencer et faire de la semi qPCR !!!
Ma question est la suivante : Y-a-t-il des conditions particulières pour désigner les amorces et la réaction PCR (tailles, %GC et AT? DMSO ou non? Nested PCR ou touch downPCR?
peut-on faire la PCR à partie d'ARNt extrait? et quels sont les conditions PCR?
Merci d'avance pour vos réponses????
2/ Je fais une banque d'ADNc de ce champignon en parallèle, mais je n'ai pas la possibilité d'avoir de la radioactivité (IRD, centre Nouméa!!!) pour suivre le sADNc néosynthètisés...
Comment puisse-je fractionner les ADNc ?
1-sur un gel d'agarose 1% pour m'affranchir des petits ADNC et des primers????
2-Colonne CL4B, mais forte dilution et pas de traçabilité???
bref suis dans la pannade....
Merci d'avance
Cla+
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