Bonjour,
j'essaie de preparer un plasmide qui n'est pas tres cooperatif. Les rendements sont tres mauvais, il se transforme plutot mal, les colonies poussent mal, tres lentement et semble ne pas tres bien se conserver (que ce soit en solution a 4°C ou en glycerol a -80°C). Le kit utilise pour la maxiprep est utilise en routine au laboratoire, on le connait donc plutot bien, les bacteries aussi. on a essaye avec plusieurs souches et les rendements sont toujours aussi mauvais. Du coup, pour ameliorer un peu tout ca, on a ajoute du chloramphenicol dans le milieu, en suivant le protocol du Maniatis. Mais les bacteries ne semblent pas apprecier du tout et meurent, de facon malheureusement assez reproductible.
J'ai deja travaille avec les versions anterieures de ce meme plasmide (que je mute par ci par la), mais dans d'autres souches de bacteries. Elles etaient deja plus ou moins recalcitrantes (notamment du fait de la taille, je pense, environ 12kb), mais c'etait gerable. Et les bacteries supportaient bien le chloramphenicol.
En gros, j'ai 3 questions:
1. On se creuse la tete depuis un moment et on ne sait plus trop quoi faire pour produire ce plasmide. Si vous avez des suggestions, je prends!
2. Et puis, je ne comprend pas trop pourquoi le chloramphenicol tue les bacteries. D'apres ce que j'ai lu, ca bloque la proliferation des cellules mais ca ne devrait pas les tuer. Une hypothese: en bloquant la synthese proteique, estce que le chloramphenicol ne rend pas les bacteries plus sensibles a l'ampicilline (le plasmide porte le gene de resistance a l'ampicilline, on cultive donc les bacteries en presence d'ampicilline, mais en concentration deja faible (50mg/mL)). chloramphenicol = absence de synthese de proteine = absence de synthese de l'enzyme qui detoxifie le milieu = toxicite de l'ampicilline. Qu'en pensez vous?
3. Et puis autre question, j'ai egalement lu que l'origine de replication colE1 pourrait necessiter un cofacteur bacterien tres instable. Cultiver des bacteries avec ce plasmides en presence de chloramphenicol ne devrait donc pas permettre d'augmenter le nombre de copie par cellules, puisque si la synthese de proteine est inhibee, le facteur en question n'est pas renouvele, donc le plasmide n'est pas replique. Il est donc conseille (toujours dixit Maniatis) de reduire la concentration de chloramphenicol.
Par ailleurs, j'ai egalement lu que certains facteurs bacteriens sont responsables de controle du nombre de copies de plasmides par cellules en reprimant l'origine de replication colE1 (c'est ce qui fait la difference entre les plasmides high et low copy, si j'ai bien compris). En absence de ces facteurs (notamment en cas d'inhibition de la synthese de proteines par le chloramphenicol), le nombre de copie n'est plus controle, ce qui permet d'augmenter le nombre de copies (et de "transformer" un plasmide low copy en high copy).
Tout ca me parait assez contradictoire... est ce quelqu'un a une expliquation?
Merci pour votre aide!!! (et pour avoir pris le temps de me lire...)
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