Clonage en plasmides de grande taille via Sfi I (astuces)

[invite9e4a3d3c]

Bonjour,
notre équipe travaille avec des plasmides épisomaux de grande taille (17kb) où est cloné un insert (2,5 kb) entre deux linker Sfi I (GGCCNNNNGGCC, on peut donc faire du directionnel avec une seule enzyme...)

Je dois recloner dans le vecteur ouvert (14,5 kb) un insert muté (2,3 kb) récupéré depuis un autre plasmide.
Par PCR j'y introduis les 2 queues Sfi I, purifie, digère puis ligue et enfin transforme mes bactéries (des DCM-/- en plus...)

Je n'ai aucune colonies, malgré plusieurs tentatives (1)

Auriez vous des astuces ou recommendations pour le clonage en plasmide de grande taille et/ou pour optimiser mes ligations (2)
(j'ai utilisé les ratio MOLAIRES insert-vecteur de 3/1 et 6/1)

(1) La grande taille du vecteur rend quasi impossible la mutagenèse par une technique, genre: Kit Quickchange (de qui vous savez)
La mutagenèse par Overlap PCR implique aussi de couper Sfi I puis recloner derrière donc je suis coincé en terme de solution alternative.

(2) pour respecter mon ratio insert/vecteur molaire théorique (tout en restant dans un petit volume) je dois mettre beaucoup d'insert ! cet excès d'ADN peut il inhiber la réaction de ligation ? 100 ng de matériel total cela vous semble une limite max à pas dépasser ?

"Cloneurs" expérimentés , merci par avance de votre aide.
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[invitea1b390f6]

Bonjour,
notre équipe travaille avec des plasmides épisomaux de grande taille (17kb) où est cloné un insert (2,5 kb) entre deux linker Sfi I (GGCCNNNNGGCC, on peut donc faire du directionnel avec une seule enzyme...)

Je dois recloner dans le vecteur ouvert (14,5 kb) un insert muté (2,3 kb) récupéré depuis un autre plasmide.
Par PCR j'y introduis les 2 queues Sfi I, purifie, digère puis ligue et enfin transforme mes bactéries (des DCM-/- en plus...)

Je n'ai aucune colonies, malgré plusieurs tentatives (1)

Auriez vous des astuces ou recommendations pour le clonage en plasmide de grande taille et/ou pour optimiser mes ligations (2)
(j'ai utilisé les ratio MOLAIRES insert-vecteur de 3/1 et 6/1)

(1) La grande taille du vecteur rend quasi impossible la mutagenèse par une technique, genre: Kit Quickchange (de qui vous savez)
La mutagenèse par Overlap PCR implique aussi de couper Sfi I puis recloner derrière donc je suis coincé en terme de solution alternative.

(2) pour respecter mon ratio insert/vecteur molaire théorique (tout en restant dans un petit volume) je dois mettre beaucoup d'insert ! cet excès d'ADN peut il inhiber la réaction de ligation ? 100 ng de matériel total cela vous semble une limite max à pas dépasser ?

"Cloneurs" expérimentés , merci par avance de votre aide.

Bonjour;
Cela fait un mois que j’essaie de réussir un clonage mais en vain. Je vois que le problème dont tu parles date du mois de novembre. As-tu trouvé une astuce ? Moi mon vecteur n’est pas aussi grand que le tien : 6kb, mon Insert fait 720pb. Les deux sont des produits de digestion NCOI et XHOI ; ma ligation est optimisée (sur la nuit), rapport vecteur/insert 1 :10 . mes bactéries sont compétentes108B/µg ADN. après transformation, aucune colonie
je compte sur vous pour m'aider
Bien j'attends vos suggestions et merci d'avance

[Zellus]

Salut,

Moi mon vecteur n’est pas aussi grand que le tien : 6kb, mon Insert fait 720pb. Les deux sont des produits de digestion NCOI et XHOI

Tu ne digères pas trop longtemps ou avec trop d'enzyme ?
Tu inactives tes enzymes avant la suite du clonage ?
Tu déphosphoryles ton plasmide après digestion ?

ma ligation est optimisée (sur la nuit), rapport vecteur/insert 1 :10 . mes bactéries sont compétentes108B/µg ADN. après transformation, aucune colonie

A quelle température tu fais ta ligation ?
Rapport vecteur:insert 1:10 ok mais tu utilises quelle quantité exactement d'ADN ? Et tu transformes avec quelle volume de ta ligation (pour quel volume de bactéries ?) ?
Tu transformes comment exactement ?

Lol désolé pour toutes ces questions mais il faudrait que tu sois le plus précis possible sur toutes les étapes du clonage pour être aidé au mieux.

[invitea1b390f6]

salut,
merci pour ta réponse et tes questions. Je m'explique:
la digestion je la fais géneralement avec 1,5 µl d'enzyme 1Hà 37°C; mais comme le signal obtenu après dépos sur gel est trop faible, j'ai augmenté la quantité d'ADN digeré (80µL dans 350 final) avec 5µl d'enzyme de digestion 1h 37°C(j'ai essayé d'amplifier le fragment par pcr , ça ne marche pas). après dépos sur gel le signal raltif à mon fragment d'interet reste faible (rapport incorrect avec l'autre fragment )mais les bandes plus visibles pour faire l'élution des bandes(kit gel extraction). j'ai déposé un aliquot à la fin d'élution j'ai eu encore un signal très faible (21ng/µL).
Ligation:
42ng insert (2,5µl)+ (36,27)4µL vecteur dans 25µL final
T4 DNAligase sur la nuit à 16°C;
DIALYSE 1/2H
transfo chez E.coli par électroporation (200om, 1.3Kvolt, 25µF)avec 3µl de la ligation/50µL de bacteries. incubation 1H 37°C
Etaler sur des boites Erythro car le plasmide porte le géne de résistance à cet ATB. Incuber pour la nuit à 37°C.
Le lendemain rien sur les boites
bon si vous avez le courage de lire tous ça. je vous serai très reconnaissante.
Encore merci.

[A voir en vidéo sur Futura]

[Zellus]

a digestion je la fais géneralement avec 1,5 µl d'enzyme 1Hà 37°C; mais comme le signal obtenu après dépos sur gel est trop faible, j'ai augmenté la quantité d'ADN digeré (80µL dans 350 final) avec 5µl d'enzyme de digestion 1h 37°C(j'ai essayé d'amplifier le fragment par pcr , ça ne marche pas).

Tu ne mets pas trop d'unités d'enzymes ? Tu digères combien de µg de vecteur et d'insert environ ? 350 µL final c'est beaucoup, tu dois pouvoir faire ça genre dans 100-150 µL max non ?

après dépos sur gel le signal raltif à mon fragment d'interet reste faible (rapport incorrect avec l'autre fragment )mais les bandes plus visibles pour faire l'élution des bandes(kit gel extraction). j'ai déposé un aliquot à la fin d'élution j'ai eu encore un signal très faible (21ng/µL).

21ng/µL c'est ce que j'ai en moyenne aussi avant ligation. Tu ne déphosphoryles pas ton plasmide alors ?

Ligation:
42ng insert (2,5µl)+ (36,27)4µL vecteur dans 25µL final
T4 DNAligase sur la nuit à 16°C;

2,5 µl d'insert à 21ng/µL ça fait 52,5 ng plutôt non ?
Enfin bref, ça fait combien d'insert et de vecteur tout ça en pmol ? Perso, j'essaie de faire en général 0,03 pmol de vecteur pour 0,03 à 0,3 pmol d'insert. Par contre, 25 µL de ligation ça me paraît trop. Si tu peux faire moins n'hésite pas parce que sinon tu dilues trop insert et vecteur.

DIALYSE 1/2H

Tiens je connaissais pas ça.

transfo chez E.coli par électroporation (200om, 1.3Kvolt, 25µF)avec 3µl de la ligation/50µL de bacteries. incubation 1H 37°C

Moi je fais mes clonages avec des chocs thermiques donc l'électroporation je connais pas très bien. Je sais juste qu'il ne faut pas que ça fasse d'arc électrique (d'où la dialyse je suppose en fait). Le rapport ligation/bactérie est bien parce qu'il vaut mieux éviter de mettre plus d'un dizième du volume de bactérie en ligation j'ai appris récemment pour éviter que ça soit trop dilué.

Etaler sur des boites Erythro car le plasmide porte le géne de résistance à cet ATB. Incuber pour la nuit à 37°C.

Pour éviter un stress de plus à tes bactéries tu peux préchauffer tes boîtes à 37°C plutôt que de les étaler sur une boîte à peine sortie du frigo.
L'antibiotique ne serait pas trop concentré par hasard ? Je suppose que non mais c'est juste pour poser une question de plus.

[invitea1b390f6]

Tu ne mets pas trop d'unités d'enzymes ? Tu digères combien de µg de vecteur et d'insert environ ? 350 µL final c'est beaucoup, tu dois pouvoir faire ça genre dans 100-150 µL max non ?

21ng/µL c'est ce que j'ai en moyenne aussi avant ligation. Tu ne déphosphoryles pas ton plasmide alors ?

2,5 µl d'insert à 21ng/µL ça fait 52,5 ng plutôt non ?
Enfin bref, ça fait combien d'insert et de vecteur tout ça en pmol ? Perso, j'essaie de faire en général 0,03 pmol de vecteur pour 0,03 à 0,3 pmol d'insert. Par contre, 25 µL de ligation ça me paraît trop. Si tu peux faire moins n'hésite pas parce que sinon tu dilues trop insert et vecteur.

Tiens je connaissais pas ça.

Moi je fais mes clonages avec des chocs thermiques donc l'électroporation je connais pas très bien. Je sais juste qu'il ne faut pas que ça fasse d'arc électrique (d'où la dialyse je suppose en fait). Le rapport ligation/bactérie est bien parce qu'il vaut mieux éviter de mettre plus d'un dizième du volume de bactérie en ligation j'ai appris récemment pour éviter que ça soit trop dilué.

Pour éviter un stress de plus à tes bactéries tu peux préchauffer tes boîtes à 37°C plutôt que de les étaler sur une boîte à peine sortie du frigo.
L'antibiotique ne serait pas trop concentré par hasard ? Je suppose que non mais c'est juste pour poser une question de plus.

les rapports que j'utilise: O.21pmol :0.021pmol vecteur.
pour l'erythro je ne crois pas qu'il soit trop concentré puisque j'ai réussi d'autres clonages dans les mm conditions.
je désespère
encore merci pour tes suggestions.
à+

[invite9e4a3d3c]

je reprends le fil de la discussion après un long moment de silence.
le clonage Sfi n'a jamais marché dans mes mains ni celles d'une de mes collègues (on a fait un brain storming critique de nos manips comparées... on suit pourtant et exactement ce qui est "recommandable")
J'ai cru arriver à cloner en passant par une ligation de type "blunt" mais les plasmides issus des clones positifs sont trop petits ??!!
Je vous mets donc en garde contre l'enzyme mung bean que j'accuse d'avoir "grignoté" mon plasmide ouvert, de façon non spécifique quand j'ai voulu le rendre blunt.
Cependant passer d'un plasmide ouvert de 17kb à quelque chose de refermé avec l'insert de bonne taille -vérif par PCR- mais de 12 kb c'est assez incompréhensible !
Travailler sur du matériel de plus de 10kb c'est assez frustrant sur gel d'agarose (on sait jamais si c'est la bonne taille) de plus c'est un vecteur issu d'une collaboration dont nous ne sommes pas 100% sur de la carte...
Face à ce bilan, on cherche d'autres pistes telles que la recombinaison homologue avec les kits de dernière génération qui semblent assez souples.
Un dernier détail: lors de la ligation je testerai plusieurs rapports insert/vecteur différents, du style: 3/1 mais aussi 1/1 on sait jamais.
Il y a la théorie claire et précise des bouquins et protocoles et ce qui se "passe" de façon invisible dans le tube. Je sais que c'est pas trop scientifique comme approche mais faut savoir sortir des sentiers battus de la bio mol (discipline ô combien frustrante dans ces cas là)
Je cherche aussi à minimiser le nombre d'étape et avoir des tampons compatibles pour éviter les pertes et un rendement trop faible.
Enfin, je recommande les bactéries thermocompétentes (je fuis comme la peste les électro...), et en contrôle je concentre mon reliquat de bactérie transformée et je ré-étale le tout si les clones sont négatifs. J'ai parfois eu de bonnes surprises comme ça
bon courage à vous et plus de chance que moi...

[invitec9f0f895]

Salut

ce n'est pas impossible qu'il y ait eut des problemes de remaniements du plasmides car justement trop gros.
Sinon pour rendre blunt les extremités cohésives j'utilise la Vent polymerase c'est génial ca marche super bien.

YOyo

[invite9e4a3d3c]

en effet ma collégue en second essai, a essayé de "remplir" les sites Sfi (avec une polymerase, Klenow) plutôt que les grignoter (avec la mung bean)
Bilan:... elle est devenue croyante et a mis des cierges à Sainte Rita (patronne des causes despérées)
On préfère en rire désormais.

[invitea1b390f6]

Tu ne mets pas trop d'unités d'enzymes ? Tu digères combien de µg de vecteur et d'insert environ ? 350 µL final c'est beaucoup, tu dois pouvoir faire ça genre dans 100-150 µL max non ?

21ng/µL c'est ce que j'ai en moyenne aussi avant ligation. Tu ne déphosphoryles pas ton plasmide alors ?

2,5 µl d'insert à 21ng/µL ça fait 52,5 ng plutôt non ?
Enfin bref, ça fait combien d'insert et de vecteur tout ça en pmol ? Perso, j'essaie de faire en général 0,03 pmol de vecteur pour 0,03 à 0,3 pmol d'insert. Par contre, 25 µL de ligation ça me paraît trop. Si tu peux faire moins n'hésite pas parce que sinon tu dilues trop insert et vecteur.

Tiens je connaissais pas ça.

Moi je fais mes clonages avec des chocs thermiques donc l'électroporation je connais pas très bien. Je sais juste qu'il ne faut pas que ça fasse d'arc électrique (d'où la dialyse je suppose en fait). Le rapport ligation/bactérie est bien parce qu'il vaut mieux éviter de mettre plus d'un dizième du volume de bactérie en ligation j'ai appris récemment pour éviter que ça soit trop dilué.

Pour éviter un stress de plus à tes bactéries tu peux préchauffer tes boîtes à 37°C plutôt que de les étaler sur une boîte à peine sortie du frigo.
L'antibiotique ne serait pas trop concentré par hasard ? Je suppose que non mais c'est juste pour poser une question de plus.

j'ai encore une question: est il possible que des colonies changent de couleur (aspect) car elle sont transformées avec un fusion traductionnelle contenant une protéine fluorescente mCherry (red).
la couleur vire au blanc nacré au lieu du blanc tout court.
il s'agit des enteroccoques.
merci d'avance