Bonjour,
notre équipe travaille avec des plasmides épisomaux de grande taille (17kb) où est cloné un insert (2,5 kb) entre deux linker Sfi I (GGCCNNNNGGCC, on peut donc faire du directionnel avec une seule enzyme...)
Je dois recloner dans le vecteur ouvert (14,5 kb) un insert muté (2,3 kb) récupéré depuis un autre plasmide.
Par PCR j'y introduis les 2 queues Sfi I, purifie, digère puis ligue et enfin transforme mes bactéries (des DCM-/- en plus...)
Je n'ai aucune colonies, malgré plusieurs tentatives (1)
Auriez vous des astuces ou recommendations pour le clonage en plasmide de grande taille et/ou pour optimiser mes ligations (2)
(j'ai utilisé les ratio MOLAIRES insert-vecteur de 3/1 et 6/1)
(1) La grande taille du vecteur rend quasi impossible la mutagenèse par une technique, genre: Kit Quickchange (de qui vous savez)
La mutagenèse par Overlap PCR implique aussi de couper Sfi I puis recloner derrière donc je suis coincé en terme de solution alternative.
(2) pour respecter mon ratio insert/vecteur molaire théorique (tout en restant dans un petit volume) je dois mettre beaucoup d'insert ! cet excès d'ADN peut il inhiber la réaction de ligation ? 100 ng de matériel total cela vous semble une limite max à pas dépasser ?
"Cloneurs" expérimentés, merci par avance de votre aide.
![]()
-----