Expression de protéines grâce au pGEX. DH5alpha ou BL21?

[piwi]

Bonjour à tous.

C'est pas tous les jours que j'ai une question. J'espère trouver la réponse ici
Voilà, j'ai cloné une protéine d'intérêt dans un pGEX en vue de réaliser plusieurs manips qui nécessitent que je puisse produire puis fixer ma protéine d'intérêt sur un support. Peu importent les manip' ce qui m'intéresse ici c'est la production de mes protéines GST-prot.
Pour l'instant j'amplifie mon plasmide dans une souche de Coli DH5alpha. Instinctivement (après mes aventures dans le monde de la production en pET) j'allais passer sur une souche BL21 peu pratique à utiliser. Puis réflechissant un peu je me suis rendu compte que finalement la souche BL21 n'a surtout d'intérêt pour la production de protéines en pET que parce qu'elle permet l'utilisation du promoteur T7 du plasmide. Or l'expression dans le pGEX est permise grâce grâce au promteur tac.
Du coup, en théorie, je n'ai pas besoin de passer en BL21. Cependant je lis que cette souche (pourrie) est quand même recommandée du fait que des protéases y sont inhibées.

Je préferais travailler en DH5alpha. Pensez que cela soit possible? L'avez vous déjà fait?

Cordialement,
piwi
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[piwi]

Comme personne ne me répond (et j'avoue que j'en suis un peu décu), je me réponds à moi même en espérant que cela puisse aider un jour quelqu'un.

J'ai transformé des bactéries DH5alpha avec mon plasmide GST et mon plasmide GST-prot d'intérêt. Pour chaque transformation j'ai effectué un contrôle non induit. J'ai testé deux stragégies d'induction avec 1 mM IPTG: 2h à 37°C ou toute la nuit à 30°C.
On observe bien une expression protéique dans les extraits déposé sur gel et coloré au bleu colloidal.
Cependant si un westernblot m'a permis de le confirmer, il a aussi montré qu'il y avait des formes tronquées dans mes extraits. Je pense que ceci pourrait être du à une dégradation. Dés lors, la recommandation d'utiliser des BL21 se justifierait. Je vais peut être faire un essai histoire de vérifier cela.

Par rapport à mon vecteur pGEX5x1 on peut aussi voir qu'il y a de l'expression de protéines même sans induction (contrôle: DH5alpha non transfectées). Au bout de 2h l'induction n'a pas franchement dépassé la production endogène. Au bout de 12h la différence est très nette montrant que l'induction active bien le plasmide. Conclusion. Le represseur LacI_q n'est pas optimal.

Conclusion: On peut produire des protéines en DH5alpha grâce aux vecteurs pGEX. Cependant la dégradation induite par les protéases ne semble pas négligeable. Le represseur LacI_q du vecteur n'eteint pas totalement l'expression du gène chimère. Peut être un problème à prendre en considération pour les protéines toxiques.

piwi

[gorben]

Salut,

Rhooo faut pas etre decu de ne pas recevoir de reponses, c'est juste que tu as poste ton message au mauvais moment.

Pour les purif de proteine y'a de toute maniere pas de recette miracle. Toutes les proteines sont differentes. Perso j'en ai purifie qui ne s'exprimaient qu'en E. coli K12 MG1655, et sur boite !
D'autres s'expriment bien en BL21, DH5a etc...

La seule solution est de tester, ce que tu as fait.

Si ton promoteur est un vrai Plac ou Ptac, tu peux rajouter du glucose a ton milieu. Ca va "augmenter" la repression et te donner un meilleur controle de l'induction.

A+

[piwi]

Salut,

Ma petite remarque ne visait pas réellement qui que ce soit. C'était plutôt une manière de souligner que je trouve que le forum change petit à petit mais surement. On a de plus en plus de questions scolaire et je peine à retrouver le forum qui était quand j'y suis arrivé. Ma question fait presque figure de question déplacée au milieu de toutes ces questions scolaires. J'ai l'impression que peu à peu les "biologistes" quittent le forum. C'est plus cela qui me déçoit.

Bon passons.

Pour mon petit boulot j'ai repris mes essais en BL21. Je poursuis deux objectifs. Tester la production ainsi que la stabilité. Je fais deux gels, un que je colore au bleu brillant G et un qui me sert à un western blot. Curieusement mon gel que je prévoyais pour le bleu a foiré. Je n'ai donc pas pu analyser mon extrait protéique qu'au rouge ponceau via ma membrane prévue pour le WB. On voit bien une bande d'induction claire. Je suppose donc que la protéine est donc mieux induite que dans les DH5alpha. Reste à savoir si elle n'est pas trop dégradée. Je verrai ça lundi, je n'ai pas eu le courage d'aller au bout ce soir.

J'ai une autre question pour ceux qui ont un peu d'expérience. Jusqu'ici j'ai utilisé un clone qui s'avère produire une protéine avec un acide aminé différent par rapport à la séquence de référence MGI. Ma protéine est hyper conservée dans l'évolution et cet acide aminé modifié se trouve au milieu d'un domaine totalement conservé. Je suis en train d'analyser de nouveaux clones pour avoir la protéine parfaite. Cependant ma question est: est ce que c'est réellement grave quand on diverge d'un acide aminé dans un domaine conservé? Est ce que vous utilisez toujours des clones codant pour des protéines parfaites pas? Au contraire, avez vous eu des expériences malheureuses à cause d'une mutation?
Voilà, ces questions pour ma culture personnelle vu que j'ai déjà engagé un nouveau screen.

Cordialement,
piwi

[A voir en vidéo sur Futura]

[gorben]

Salut,

Salut,

Ma petite remarque ne visait pas réellement qui que ce soit. C'était plutôt une manière de souligner que je trouve que le forum change petit à petit mais surement. On a de plus en plus de questions scolaire et je peine à retrouver le forum qui était quand j'y suis arrivé. Ma question fait presque figure de question déplacée au milieu de toutes ces questions scolaires. J'ai l'impression que peu à peu les "biologistes" quittent le forum. C'est plus cela qui me déçoit.

Bon passons.

Generalement le forum est "cyclique" quand on se rapproche des partiels, des tonnes de questions de cours arrivent, alors que juste apres ou pendant les vacances c'est plus calme et plus "scientifique".
De meme, par experience personnelle je me suis rendu compte que poster une question le vendredi ou le week-end etait une mauvaise idee. Beaucoup consultent le forum dans la journee au labo, et une question posee le week end se retrouve vite en deuxieme page le lundi matin...

J'ai une autre question pour ceux qui ont un peu d'expérience. Jusqu'ici j'ai utilisé un clone qui s'avère produire une protéine avec un acide aminé différent par rapport à la séquence de référence MGI. Ma protéine est hyper conservée dans l'évolution et cet acide aminé modifié se trouve au milieu d'un domaine totalement conservé. Je suis en train d'analyser de nouveaux clones pour avoir la protéine parfaite. Cependant ma question est: est ce que c'est réellement grave quand on diverge d'un acide aminé dans un domaine conservé? Est ce que vous utilisez toujours des clones codant pour des protéines parfaites pas? Au contraire, avez vous eu des expériences malheureuses à cause d'une mutation?
Voilà, ces questions pour ma culture personnelle vu que j'ai déjà engagé un nouveau screen.

Tu es chanceux comment?
Perso, OUI j'utilise toujours la proteine parfaite. Pour la simple et bonne raison que si elle ne l'est pas, tu pourras toujours te faire attaquer sur le fait que ta conclusion est peut etre due a la mutation...
J'ai deja eu une mutation ponctuelle dans :
LacZ --> non fonctionel
Un represseur --> ne se fixe plus a l'ADN

Apres d'autres mutations ne semblent pas affecter la fonction, mais tu ne pourras jamais prouver que ton resultat est correct.
Par contre, ne jette pas ton clone "mutant" il pourra etre interessant plus tard dans le cadre d'une mutagenese pour une etude structure/fonction.

A+

[piwi]

Tu es chanceux comment?

C'est pas vraiment une question de chance. Je suis intimement convaincu que cette protéine en a après moi. Si une merde peut arriver dans ce projet elle se produit. La moindre manip' est un véritable challenge. Un vrai combat
Pour mon clone je ne vais pas le jeter comme cela étant donné que j'ai déjà produits des versions tronquées de la protéine. Si a un moment donné le domaine vient à devenir intéressant (je pense qu'il s'agit d'un domaine servant à maintenir la conformation d'un autre domaine de la protéine) il pourra peut être refaire surface.

Pour le forum, j'ai posté alors que je lançais la manip' et comme j'avais les deux lignées de bactos j'ai posé la question dés fois que la réponse fuse. Alors ben oui, on était dimanche...

En tout cas merci de tes réponses. Je trouve ça sympa de discuter un peu de réalisations plutôt que de théorie.

[gorben]

Pour le forum, j'ai posté alors que je lançais la manip' et comme j'avais les deux lignées de bactos j'ai posé la question dés fois que la réponse fuse. Alors ben oui, on était dimanche...

C'est pour ca qu'on travaille pas le dimanche, pour eviter d'avoir des questions sans reponse !!!!

A+

PS: pourquoi est ce que tu n'aimes pas BL21?

[piwi]

Je trouve que ça se met pas bien en compétence, que ça pousse pas très bien, que les colonies sont moches, et que ça transforme pas super non plus. (je fais sans doute un peu trop là non?)
Maintenant ça vient d'un préjugé dû à une première expérience pénible avec un pET. C'est vrai que le souci venait du saligot qui m'avait refourgué le plasmide qui lui était réellement véreux (d'ailleurs je dois aussi à cet olibrius une souris et un anticorps pourri... J'ai perdu un temps fou à essayer de tirer ce que je pouvais de ces outils ou à simplement essayer de les contourner.).

Je leur en veux pas à ces BL21, j'ai fais mon test aujourd'hui et ça semble avoir marché. Si mes prots ne sont pas dégradées je serais réconcilié.

[Zellus]

Salut,

Au labo je fais des transfos de BL21 DE3 Codon plus avec pGEX ou pET et l'expression marche très bien. Par contre j'ai jamais utilisé de DH5alpha.

[piwi]

Hello.
Me revoilà avec les résultats de mon petit test d'induction en BL21. L'induction (2 heures) semble avoir parfaitement fonctionné et j'obtiens donc ma protéine (exposition du WB à l'ECL à peine 1 seconde suffit). Parfait! Seulement j'ai toujours ces bandes parasites que je trouvais dans les DH5alpha et que j'attribue à de la dégradation. Le profil est absolument reproductible (nombre de bandes, intensité relative des bandes) d'une lignée à l'autre et il n'y a plus de bande sous les 30Kd (taille de ma GST). Ce qui m'ennuie c'est que normalement les protéases sont inhibées en BL21.
Alors soit c'est bien de la dégradation mais à quoi est elle due? Soit ça n'en est pas et alors qu'est ce que c'est? Des produits de synthèse avortés?

Dans vos manip, avez vous des WB clearcut après induction (une seule et unique bande)? Ca vous inquieterait ou pas?
Pour ma part je note que ma protéine est très largement majoritaire et j'aurais tendance à accepter cela. Mais peut être ai-je tord.

Cordialement,
piwi

[gorben]

Salut,
Ton WB est fait avec quoi comme Ac? GST ou specifique de ta proteine? Est ce que ton Ac est bien specifique?
Tu as essaye de deposer moins de proteines? souvent si la charge est +++ ca fait des trucs tres bizarre durant la migration et le WB.

Ca peut aussi etre un probleme d'expression. Est ce que tu as des codons rares dans cette proteine? Des structures II qui peuvent empecher l'expression?

A+

[piwi]

A priori pas de codon particulier. La conformation réelle de la protéine est inconnue, elle n'est homologue a aucune autre. Mon but est justement d'aller vérifier certaines hypothèses quant à sa structure/fonction.

Pour l'anticorps c'est un anticorps polyclonal commercial dirigé contre ma protéine et qui fonctionne pas mal dans les autres applications pour lesquelle je l'utilise. En revanche ce dont je suis à peu près certain c'est spécificité de ce WB. J'ai co-migré de l'extrait protéique non transformé et la colonne reste totalement vide. De la même manière j'ai co-migré un extrait protéique obtenu après transformation des bactéries avec un pGEX vide et là aussi la colonne reste entièrement vide. Ces contrôles signifient bien que mon anticorps ne marque pas une protéine bactérienne endogène ou un bidule provoqué par l'insertion du seul plasmide. Il faut ma protéine pour que l'anticorps se fixe.

Je reviens sur mon WB et le temps d'exposition. Une seconde suffit pour avoir un résultat en BL21, 2 secondes en DH5alpha avec 20µl de culture bactérienne. Par ailleurs, un rouge ponceau sur la membrane était suffisant pour voir la bande induite. Ceci aurait tendance (enfin j'imagine naivement) à signifier que l'induction protéique est très efficace. Dans ces conditions, n'est il pas normal que l'on ait un peu de casse?

En tout cas merci de vos réponses. Je n'ai pas trop trop d'expérience dans cette partie production et j'aimerais ne pas trop perdre de temps dans la mise au point. Votre aide m'est précieuse.

Cordialement,
piwi

[invitec99d9c39]

Salut,

Je profite de cette discussion pour poser une question presque en rapport
Je n'ai jamais produit de proteine de fusion. J'avais besoin d'une construction et au lieu de recevoir un "simple" plasmide, j'ai recu une construction dans un pGEX. Je suppose que c'est pour produire ma prot en fusion avec les GST??!
Y-a-t-il un moyen que je transfecte ca dans des cellules eucaryotyes? Je pense que je connais la reponse mais je tente... Ou bien il me faudra sous-cloner ma sequence dans un autre plasmide genre pcDNA3 classique par exemple, n'est-ce pas? (si j'arrive a connaitre les enzymes de restriction pour ce faire...)
merci d'avance

[gorben]

Pour l'anticorps c'est un anticorps polyclonal commercial dirigé contre ma protéine et qui fonctionne pas mal dans les autres applications pour lesquelle je l'utilise.

A ta place j'essaierai de re-hybrider la membrane (ou encore mieux re-run) avec un Ac anti GST (y'en a commercial) histoire de voir si c'est un clivage : ou il est, et si c'est un probleme d'expression, si c'est en 3' ou 5'.

Je reviens sur mon WB et le temps d'exposition. Une seconde suffit pour avoir un résultat en BL21, 2 secondes en DH5alpha avec 20µl de culture bactérienne. Par ailleurs, un rouge ponceau sur la membrane était suffisant pour voir la bande induite. Ceci aurait tendance (enfin j'imagine naivement) à signifier que l'induction protéique est très efficace. Dans ces conditions, n'est il pas normal que l'on ait un peu de casse?

La BL21 est inactivee dans certaines proteases, mais pas toutes. E. coli a des tonnes de proteases. De memoire il y a Lon et peut etre une ou deux autres mais pas plus sinon la cellule ne serait pas viable.
Comment prepares tu tes echantillons pour le WB? peut etre que ta degradation intervient lors de ta prep. Si c'est juste : resuspension du culot bacterien dans le laemmli puis boil 5' c'est pas terrible pour les proteines. Perso je precipite les proteines au TCA tout en gardant a 0 deg le plus possible. C'est la methode qui est utilisee generalement pour les WB sur les etudes de stabilite proteique. Ca evite les degradations.

Vois tu ces extras bandes en coomassie?

Essaies vraiment de deposer moins de proteine. Generalement quand j'induis une proteine, je dilue mon extrait jusqu'a avoir une bande (tres) fine en coomassie, puis je fais un WB. Le WB est vraiment plus sensible que le bleu. Tu vas donc detecter des produits meme tres minoritaires.

Enfin, ce que tu veux eviter c'est des proteines tronquees, c'est pour ca que le WB avec un anti GST est important. Tu pourras voir ou ta proteine est tronquee. Si le tag est vire ca ne pose pas de probleme puisque tu ne vas pas purifier la proteine restante sur ta colonne. Par contre si tu as le tag et une partie de la proteine la c'est embetant...

Tu comptes enlever ou laisser le tag?

A+