pas d'ADN extrait

[invitecec8c703]

bonjour,
j'ai fait un TP aujourd'hui d'extraction d'ADN.
la methode utilisée est celle utilisant le phenol/chloroforme/alcool isoamylique.
sur mes 6 groupes, aucun n'a pu precipiter d'ADN.
les seules choses qu'ils ont en commun sont :
- les cellules : elles étaient assez vielles et y'avait des debris en observant au microscope.mais la prof responsable du TP ne pense pas que c'est du à ses cellules
- les solutions d'extraction : pas de probleme de calcul de concentration.le seul truc est le phenol qui était à temperature ambiante. toujours d'apres la prof, s'il n'est pas froid, le phenol peut avoir de l'affinité pour l'ADN.

j'aimerais donner un explication à mes eleves (et aussi eviter que ça recommence à la prochaine seance). avez vous des idées sur le probleme?
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[piwi]

Est ce que vous avez mis des sels dans vos cellules avant de le lyser au phénol?
Si vous les avez rincées à l'eau par exemple, vous étiez peut être simplement en dessous des 200mM de sels (NaCl ou peu importe) nécessaires à ce que l'ADN précipite dans l'EtOH. Dans ce cas là, pas de pelote!

Cordialement,
piwi

[invitecec8c703]

avant le phenol, il y a des lavages avec du PBS.puis on ajoute le tampon de lyse aux cellules(PBS, SDS, EDTA, tris, pronase, NaCl) qu'on incube 45 min à 60°C.
c'est un TP qui tourne depuis des années et le protocole est toujours le meme et, normalement il marche.

[piwi]

Effectivement ça n'est pas ça...
L'ethanol n'était pas trop vieux? Genre un bidon qui a trainé dans un coin depuis 1 an?
Sinon je ne vois pas trop. Il y a peut être trop peu de cellules. Vous avez tenté une petite DO pour voir si vraiment vous ne ramassez rien?

[A voir en vidéo sur Futura]

[invitecec8c703]

l'ethanol sortait du congel.
les cellules, il y en avait enormement (100 fois plus que d'habitude).mais elle étaient tres degradées
tu penses que l'hypothese du phenol resté à temperature ambiante peut etre bonne?

[piwi]

Ben au point de ne plus rien avoir.... Quand même!
En général le phénol au mauvais pH émiette l'ADN et fait que l'on ne voit pas de pelote. En revanche on a un culot après centri. J'ai jamais eu un phénol qui capte l'ADN à ce point. Maintenant faut une première à tout. Faudrait que j'essaie pour voir.
Je tente le coup du phénol à TA demain (j'en ai pour 5 minutes et ça m'amusera un peu). Verrai bien ce que ca donne.

[invite10adf645]

Pourquoi l'EtOH peut-il poser problème s'il est vieux ?

Je pensait que c'était super stable, on le garde dans un gros bidon sous une paillasse, et il est pas tout jeune !

NB : je n'utilise pas d'EtOH pour extraire l'ADN (juste soude puis Tris), par contre si ça peut être un problème pour mes ARNs ça m'intéresse !

[piwi]

Tu le précipites comment sans ethanol?

Sinon, si tu laisses un vieu bidon à moitié ouvert l'alcool s'évapore. Je suis d'accord sur le fait que ca doit prendre un bail avant que le taux d'ethanol diminue de manière significative. M'enfin dans les salles de TP....

[invite10adf645]

En fait je ne le précipite pas, c'est juste pour faire un génotypage rapide de mes souris sur un petit bout de queue.
Je les incube dans la soude, je fais bouillir tout ça, je vortex à fond puis je neutralise avec le Tris.
Enfin je fais une centri rapide pour éliminer les débris cellulaires, poils etc...

Ca coute rien en produits, ça prends moins d'une heure, et ça suffit largement pour une PCR toute bête. Je ne m'amuse même pas à doser, j'utilise toujours le même volume de mon extraction.

Bon pour l'EtOH je suis rassuré si le seul danger est l'évaporation !
Merci !

[piwi]

Moui ca suffit pour une petite PCR de génotypage... Mais parfois les PCR sont dégeux.