Bonjour,
Je suis chercheuse en cancérologie et je vais débuter dans un domaine que je ne connais absolument pas, je dois cloner deux séquences d'un gène bien spécifique, et pour cela je dois cloner cela par PCR.Le problème est que je ne sais mm pas designer des primers, donc j'aimerais un peu d'aide dans ce domaine , pour ne pas faire de bétises. Merci d'avance
Bonjour.
Le plus simple est de faire du AT cloning avec soit le pDRIVE de qiagen (je crois) ou le pGEM-t easy (promega) voir du GC cloning avec le vecteur pSMART (lucigen) (comme ça j'aurais fais le tour de la question sans faire de favoritisme)
L'idée est de faire votre PCR et de la rentrer directement dans vos vecteurs sans vous poser plus de question.
Pour la PCR le site internet qui va bien est primer3. Vous entrez votre séquence et il vous donne des oligos qui fonctionneront dans 95% des cas. Si vous souhaitez amplifier de longfragments (>3kb) pensez à utiliser une PCR long range (type long expent de chez Roche). Cependant le défaut de la cuirasse est que si elle est procéssive, sa fidélité est douteuse. Il me semble qu'il y a une Taq miracle pour les clonages, phusion ou un truc dans le genre. Je ne l'ai jamais essayée.
La PCR nécessite parfois un rien de mise au point pour n'avoir qu'une seule belle bande. Mais c'est important parce qu'avec les vecteurs que je vous ai cité, tout fragment rentrera. Je pense personnellement qu'il est bien de purifier le fragment une fois que l'on est OK. phénol/chloroforme ou encore un kit de purif tel que nucleospin extract II (Macherey-Nagel)
Vous faites pousser sur une boite et le lendemain vous faites des miniprep et vous faite séquencer afin de sélectionner un bon clone et pas un truc tout tordu.
Cordialement,
piwi
Je sers la science et c'est ma joie.... Il parait.
merci de m'avoir épondu aussi rapidement, si je souhaitais utiliser d'autres vecteurs, tq le plasmide pcDNA3.1 hygro+, pensestu que ce serait réalisable?
J'imagine que vous êtes bien conscient(e) que l'intérêt de ce plasmide est de faire de l'expression dans des cellules eucaryotes.
Sinon, oui c'est possible mais ce sera un peu plus compliqué. Ce qui change c'est que vous n'êtes plus en AT ou GC cloning ce qui signifie qu'il va vous falloir faire des digestions de restriction (bon choix des enzymes, quelques tests et purifs en plus) et surtout tenir compte de la phase (si vous souhaitez réellement faire de l'expression)
Afin de mieux vous aider, pouvez vous préciser un tout petit peu votre objectif? (je ne vous demande pas de révéler votre projet de recherche. C'est évident)
Cordialement,
piwi
Je sers la science et c'est ma joie.... Il parait.
c'est vrai que je suis restée bien évasive sur le sujet et omis des élements importants, et je m'en excuse. Le but est d'exprimer la séquence clé dans un type cellulaire sain bien particulier pour voir si cette séquence peut avoir un effet tumoral sur ce type cellulaire. le système cellulaire est eucaryote: des cellules humaines issus de l'endothélium vasculaire.Il est vrai que je suis complétement néophyte à tout cela , et j'ai essayé de designer des primers avec des enzyles de restriction bien particulières, mais je ne sais pas si ce que j'ai fait est vrai, car je me suis positionné bien avant mon ATG pour designer mon primer sens, et je ne sais pas si cela décaleras mon cadre de lecture entre autre. Et ce que je souhaiterais c'est voir s'il nexiste pas de protocole pouvant récapituler les étapes pour procéder à cela, éviter de faire des bétises, etc
Faut que je regarde un peu mieux la doc de votre plasmide. Je n'ai qu'une carte un peu incomplete.
.....
Voilà qui est fait.
La doc se trouve ici si vous ne l'avez pas déjà consultée: http://www.addgene.org/pgvec1?f=c&cm...fo&vectorid=26
On voit la tronche de la cassette de clonage en page 3. On voit qu'il y a déjà un start dans le plasmide et un codon stop sur le site de restriction XbaI. Vous devez donc retirer le start de votre gène et éventuellement le stop.
L'oligo doit avoir cette tête
5'____EZ1CODON2_________STOP(ou pas si vous clonez en Xba)EZ2___3'
Choisissez bien vos enzymes de sorte à ce qu'elle ne soient pas dans votre insert (voyez sur webcutter). N'oubliez pas d'ajouter au moins 6 nucléotides au début et à la fin de votre oligo pour que les enzymes de restrictions puissent se fixer (endonucléases)
Je sers la science et c'est ma joie.... Il parait.
