HEK et nitrogène

[invite37d66f93]

Bonjour,
je cultive depuis plus d'un an une lignée HEK293 transfectée avec un plasmide donnant une résistance à la néomycine. Avec le temps mes cultures ont de plus en plus de mal à redémarrer (même les échantillons à faible passage) et je me demande s'il ne s'agit pas des conditions de stockage (mon protocole de culture n'a pas varié depuis). Je maintiens mes stocks à -80°C au lieu du "liquid nitrogen", est-ce que ces conditions de stockage peuvent expliquer ces problèmes de pousse ? (les cellules décongelées ont l'air saines et nombreuses les premières heures de mise en culture puis elles restent en suspension et ne s'attachent que très difficilement à la boite... La majorité finit par mourir)
Merci pour un conseil
E
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[inviteec077029]

Avez-vous changer de SVF ? Parfois juste un numéro de lot différent et op soucis les cellules n'aiment pas trop.
regarde le moindre petit truc qui à changer regarde même le plastique sur lequel les cellules sont mise en culture

[invite37d66f93]

Même boite depuis le début, pour le SVF (j'emploie en fait du bovine growth serum, moins cher) le lot que j'utilise convient tout à fait après que les cellules aient redémarré, le problème réside vraiment au moment de redémarrer des échantillons congelés comme pré-cité.

E

[piwi]

Si elles ne s'attachent pas c'est peut être que la majorité est déjà morte et que c'est lors de la congélation que vous avez eu un problème.

Cordialement,
piwi

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite37d66f93]

Cela me fait rebondir sur la question de la congélation : 1) faut-il une congélation rapide des échantillons ou lente (j'ai essayé les 2 moyens : de -20°C pendant qq heures puis au -80°C ou bien direct dans la carboglace, avec au final le même problème de repousse) ?
2) est-ce que le maintient à -80°C est suffisant ? Faut-il absolument une congélation au nitrogène pour un stockage de plusieurs mois ?
Merci pour vos réponses
E

[piwi]

Je ne l'ai pas fais moi même donc je ne peux pas vous aider d'expérience. Cependant ce qui est certain c'est que la congélation directe n'est pas indiquée. Il faut utiliser des ampoules spéciales que l'on plonge dans je ne sais plus trop quel bidule (pas immédiatement de l'azote liquide) qui va refroidir progressivement les cellules. Ce n'est qu'ensuite que l'on congèle à -80°C

[invite37d66f93]

Merci et donc pour le stockage, pensez-vous que le -80°C ne serait pas suffisant ? Je en vois que cette raison puisque j'obtiens le même résultat en congelant rapidement ou lentement...
E

[piwi]

-80°C c'est bon une fois que les cellules sont congelées.
Ce qui pourrait poser problème c'est votre technique de congélation qui dégraderait les cellules. Ensuite une fois à -80°C ça ne bouge pas mais quand vous souhaitez les remettre en culture ben là, vous avez bien des cellules mais elles sont mortes.
Quels sont exactement vos protocoles de congélation?

[invite37d66f93]

J'ai essayé 2 protocoles différents : a) mettre mes échantillons dans cryotube et congeler pendant 10 min dans de la carboglace avant le -80°C
b) mettre mes échantillons dans cryotube et congeler pendant qq heures (4-7h) à -20°C puis mettre à -80°C. Ensuite quelque soit le protocole utilisé, lorsque je veux réutiliser mes échantillons, je décongèle rapidement (2 min dans bain Marie), centrifuge 100g, 5 min pour enlever DMSO, récupération du culot et distribution. L'une comme l'autre me donne des cellules qui ne s'accrochent pas...

[invite37d66f93]

J'ai trouvé ce complément d'info sur les cellules de Mamm en général, vraisemblablement d'après cet auteur, le -80°C n'est pas suffisant pour arrêter toute évolution des cellules. L'explication de la congélation est aussi intéressante - maintenant sachant que mes échantillons sont déjà congelés rapidement et progressivement et que j'ai le même résultat final, je ne suis pas sûr d'avoir une solution à mon problème. Je vais tenter de changer de sérum pour faire redémarrer mes cellules, puisque certains parlent de problème avec certains lots de sérum... Je suis toujours preneur de conseils - merci

In my experience, most viability issues that arise after thawing can be remedied by freezing down an absolute ton of cells in each vial. When I freeze cells (which is a pain and I don't like to do very often) I freeze many vials that are very heavy. I take T150 flasks (usually at least two per cell line I am freezing) and wait until they are in log-phase. The flask is usually 80% confluent. You want to make sure they are ramping up growth wise and not too confluent. Then when they come out of the freezer they will still be in that mode. I change the media 24h before I plan to freeze the cells.

I freeze about 5 cryo vials per 150 flask. If it is Friday and there are not as many cells as I would like, I use less vials. The important part is lots of cells. I freeze in regular complete medium with 10%FBS and 7.5% DMSO. No antibiotics. I keep the cryo tubes on ice while I am working and keep everything as cool as possible. Then aliquot the cells out into the tubes (on ice) and put into -80C. You want them to cool at the rate of 1 degree per minute. I usually leave them overnight or a couple days if I forget about them.

The reason you cool the cells slowly is that between 0 and -20C ice crystals begin to form increasing the solute concentration of the medium (which is why I use complete medium to freeze in, it is osmotically balanced). As this happens, water moves out of the cells, dehydrating the cells and shrinking them. If you cool to rapidly, ice crystals can form inside the cells since the water has not had time to move out. Then the cells will die when you thaw them. Although if the cooling is too slow the cells will suffer from the dehydration and die when you thaw them. Mammalian cells have a very narrow window for freezing, which is why cryopreservation agents are used. These don't really effect ice crystal formation, they just protect from the dehydration effects.

Once the cells are moved to -130C or below, time essentially stops for them since that is the point where water is like glass. No biological processes occur. Storing cells at -80C still allows cellular damage and changes to occur.

Thawing: I thaw at 37C, but don't let the cells get that warm, when there is still a bit of ice left, move to a tube of media. I pellet to get rid of the DMSO, but I only pellet at 200xg. Then plate, change media in 24h, split 24h after that.

A note on cryo tubes: It is dangerous to store tubes with no gasket in liquid nitrogen. They are only designed for the part of the freezer where there is only gas. If liquid nitrogen gets inside these tubes, they can explode. I currently have tubes like this in the liquid nitrogen, so inorder to save valuable cells, I immediately loosen the caps on these tubes when I take them out. Not very far, just enough for them to hiss a bit. But don't tighten the cap back down, that can force crap into your vial.

[piwi]

Il me semble que l'on m'avait conseillé 100% sérum. A vérifier...
Il pouvait bien y avoir un peu de DMSO, je ne sais plus; il faudrait que je retrouve les notes que j'avais prises à cette réunion. Ca doit trainer dans un coin, mais où...

[invite8c0cc995]

En général, on met 10% DMSO pour éviter la formation de cristaux d'eau lors de la congélation, cristaux qui, s'ils se forment dans les cellules, vont perforer les membranes. Pensez à quoi ressemble des fruits congelés une fois décongelés.
Ensuite, -80°C, c'est bien pour du cours terme, mais pour du long terme, il faut absolument mettre les cellules dans l'azote. Des stables que j'avais au -80°C pendant 1 an et demi ne sont jamais repartis ! Car meme si on peut se dire que -80°C "bloque" les processus biologiques, il ne faut pas oublier que le -80 ne reste pas toujours à -80. Si les ampoules sont dans une simble boite en carton, sans système isotherme, proche de la porte, à chaque ouverture du -80, elles vont être en contact avec le l'air plus chaud. Et pire, si le -80° tombe en panne, les ampoules sont perdus, ou si par chance il y a un -80 de secours, les ampoules seront à certains temps à température ambiante...
Donc par mesure de sécurité, pour le long terme et le stock, toujours une ampoule dans l'azote.
Un labo aux USA a perdu l'integralité de ses clones stables KO et rescue par défaillance du -80 sans sauvegarde dans l'azote !

[invite37d66f93]

Je comprends le truc de l'azote, j'ai bénéficer de cette condition aussi aux USA lors d'une stage post-doc. Pour ce qui concerne mon problème actuel, lorsque je sème me cellules fraîchement décongelées et que j'observe ma boite au microscope il me semble qu'elles ont un aspect tout à fait correct en suspension... Quelques heures après elles restent toujours en suspension et finissent par se nécroser - j'ai essayé avec 2 types de cellules (cellules natives HEK et cellules HEK transfectées), le résultat est le même : elles ont du mal à redémarrer. J'utilise du DMSO à 10% pour les congeler, est-ce que quelqu'un a eu un problème avec ce produit avant (c'est le seul point commun que je vois)
Merci

E

[invite37d66f93]

Plan pour les prochaines cryocongélations : utiliser soit un DMSO filtré (0.2micro) soit du glycérol (stérilisé, 120°C, 1 bar 15 min). Et faire une congélation lente des échantillons (SVF ou FBS + 10% DMSO ou gly)
N'hesiter pas à écrire si vous voyez qq chose à rajouter.
Merci

E