Lipofectamine 2000 et antibiotiques ?

[invite24b5c391]

salut à tous

c'est un peu en stress que j'écris ...
je viens de me rendre compte que j'ai fait une boulette sur une grosse manip hyper importante et que je ne peux pas refaire car je n'ai plus assez d'échantillons ...

j'avais 22 transfections à réaliser, nous utilisons de la Lipofectamine 2000 et pour la 1ere fois (faut dire que ça ne me réussit jamais de bosser le week-end), j'ai oublié de mettre du DMEM sans antibio (gentamicin) pour la transfection ; or sur la notice, il y a marqué un truc qui fait froid dans le dos, à savoir n'utilisez pas d'antibiotiques avec la lipofectamine car cela entraîne la mort des cellules

ma question : est-ce que qn a déjà transfecté en présence d'antibios et cela a-t-il quand même marché ou cela a-t-il été la cata ????

Merci d'avance ....
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[Vinc]

Bonjour!
Pour la lipo 2000 je ne sais pas mais pour la lipo classique l'absence d'antibio est surtout nécessaire pour que la transfection fonctionne, pas tellement pour préserver les cellules (la lipo étant de toute façon assez toxique).
Je pense que le risque est que tu pourrais ne pas avoir transfecté...

V.

[invite24b5c391]

Finalement, les cellules ne sont pas mortes (je leur ai changé le milieu au bout de 4h hier pour limiter les dégâts) et la transfection contrôle par un vecteur GFP a marché (cellules vertes ce matin) ; j'ai peut-être un % moindre que d'habitude cependant ...
j'espère que le reste des transfections sera ok aussi !

voilà pour les nouvelles ...
la prochaine fois je ferai quand même plus gaffe, j'ai un peu flippé !

merci
à+

[invite8ea281e7]

Coucou,

Je profite de ce fil de discussion pour poser des questions... je suis nouvelle sur ce forum et je ne sais pas trop ou poster, j'espère que ça ne pose pas de problème.

Voilà, je travaille dans un labo "de levure" et on commence à travailler sur des cellules humaines (HEK293T et HeLa). Seulement je n'ai AUCUNE expérience... (et évidemment personne d'autre dans le lab...). J'aimerais donc un avis de votre part.

Je dois donc procéder à une inactivation par RNA interférence sur des cellules HeLa, je compte les transfecter à l'aide de la lipofectamine rnaimax en plaque 6 puits.
Est-ce que quelqu'un aurait un protocole à proposer?

Merci pour votre aide.

[A voir en vidéo sur Futura]

[LXR]

Bonjour et bienvenue sur Futura Sciences,

Sur le site d'Invitrogen (où tu as acheté ton RNAi max), ils ont une base de données de lignées cellulaires qu'ils ont testé pour diverses transfections : Cell Lines database. Sur cette page, on voit tes cellules, les HeLa (mais aussi les HEL293 si tu es intéressé, il n'y a qu'à cliquer). Le protocole RNAi max attaché à ces cellules a été optimisé par Invitrogen et est donc disponible, tu as de la chance (en même temps les HeLa sont très courantes) : Protocole RNAi max pour cellules HeLa.

NB expérience personnelle sur les transfections : quelques points fondamentaux pour qu'une transfection marche :

- densité cellulaire faible à moyenne : nombre de liposomes/cellule fort donc meilleure efficacité de transfection/cellule,
- utiliser un milieu de type OptiMEM adapté aux transfections et surtout sans sérum. En effet, l'agent de transfection est des liposomes cationiques qui sont donc chargés positivement. Tout ce qui est chargé négativement va se coller aux liposomes et neutraliser leurs charges positives. Celles-ci sont nécessaires pour interagir avec les polysaccharides de la membrane des cellules qui sont globalement négatifs (via leurs hydroxyles). Le sérum étant riche en molécules complexes possédant plus ou moins de charges négatives, les liposomes sont vite saturés. Il est donc conseillé aussi de bien laver les cellules avant transfection avec du PBS pour les débarrasser de toute trace de sérum.
- Eviter les antibiotiques. Certains enlèvent les antibiotiques à partir du moment où ils ensemencent les cellules qui seront transfectées le lendemain ou le surlendemain. Personnellement, je ne les enlève que dans le mélange de transfection et ça a toujours bien marché. Dans tous les cas, les antibiotiques sont réintégrés (ou pas car certains groupes travaillent sans antibiotiques pour toutes leur manips) juste après la transfection. Je ne connais pas bien les effets des antibiotiques sur les étapes de transfection. Il y aurait un effet toxique accrue sur les cellules, et cela diminuerait l'efficacité de transfection, je n'en sais pas plus....

Pour les siRNA, je te conseille ceux de Dharmacon, beaucoup moins chers (5 nmol à 280€ environ, 10 nmol 480€ environ, ils marchent encore à 10 nM) et plus efficaces que ceux de SantaCruz (3 nmol pour 250€ environ, en dessous de 50 nM j'ai jamais observé d'extinction) (pour mon expérience personnelle, et ayant testé les deux compagnies pour ces produits).

Pour les concentrations en siRNA, généralement 50 nM est la concentration qui marche pour tous les siRNA que j'ai pu tester (environ 3 gènes différents en tout sur 3 lignées cellulaires différentes, donc pas énorme...). Cela peut te permettre dans un premier temps de définir à quel temps tu as la meilleure extinction (entre 24 et 72 heures en ARNm, entre 48 et 96 heures en protéines). Moi je teste l'extinction en Western Blot avec les temps 48, 72 et 96 heures. Une fois le temps défini, tu peux essayer plusieurs concentrations pour voir quelle est la meilleure, je fais 10, 20 et 50 nM. Il peut arriver de pousser jusqu'à 100 nM quand un siRNA marche mal... A partir de là, tu peux vraiment commencer les manips publiables (toutefois ne pas négliger les westerns montrant l'extinction de la protéine par le siRNA car ils sont demandés par les revues)

Bonne chance,

Greg

[invite8ea281e7]

Whaouw! Un grand merci pour tes conseils

Je vais jeter un coup d'oeil, je crois avoir toutes les infos mais comme c'est un truc que je n'a jamais fait, je n'ose pas trop me lancer car j'ignore absolument tout de toutes les étapes et contrôles importants à réaliser... Encore une mini question: c'est un labo voisin qui m'a appris les bases de la culture cellulaire, et ils ne lavent pas les cellules avec du PBS mais avec de la trypsine, cela change qqchose???

Je repasserai poser les dernières questions avant de me lancer dans l'aventure.

Bonne journée!

[Flyingbike]

la trypsine sert à décoller les cellules adhérentes.

[invite8ea281e7]

Me revoilà!!!

Toujours au sujet du RNAi...

C'est une manip' q je réalise pour la première fois, et je ne connais personne qui pourrait m'aider dans le labo, je compte donc sur vos bons conseils.

-Greg, tu dis utiliser une concentration de RNAi de 50nM, mais sur le protocole de la lipofectamine RNAiMAX, ils conseillent de démarrer avec 10nM, est-ce parce que cet agent de transfection est particulièrement efficace ou bien devrais-je faire comme toi?

-De deux, j'aimerais savoir s'il est nécessaire de procéder à deux transfections de suite (dans le même puits), comme je l'ai lu dans un papier?

Merci.

[invitebc21e9ec]

Bonjour,
Je fais pas mal de transfection de siRNA et j'utilise des nanopeptides ou du RNAiMax de chez invitrogen, dans des cellules A549 et ATTII. Je suis tout à fait d'accord avec Greg au sujet des concentrations de siRNA! Si à 50nM ton si ne fait rien, il faut en prendre un autre. En général mes siRNA fonctionnent tous à 10-20nM. Par contre un problème qui peut se poser c'est de trouver un bon siRNA control negatif. Soit prendre ta séquence de siRNA qui fonctionne pour en faire un scramble qui ne match avec rien en blast, soit de prendre ceux que les compagnies proposent, mais en ce qui me concerne, je ne les aime pas du tout! J'ai beaucoup de variation avec ces controles sur mes ARN d'intérêt.

Il faut savoir que le RNAiMax est beaucoup moins toxique que la lipofectamine 2000, du coup tu n'es pas obligée de rincer après ton temps de transfection (4 à 6h), mais je conseille quand même.
Par contre je ne fais pas deux transfections consécutives mais une une seule.
Pour mes cellules j'ai plus de 90% d'efficacité avec un siRNA fluorescent.
Je te conseille fortement de commencer par ce test pour visualiser comme il faut ton efficacité de transfection. (GAPDH-Cy3 par exemple)

Je laisse l'OptiMEM pour une durée de 5h, puis je change mon milieu en remettant mon milieu de culture normal (FBS compris). J'ai tendance à privilégier la culture sans antibio pour me débarasser du problème "avec" ou "sans" et ca evite d'avoir plein de milieu en stock.

Une question, est-ce qu'il s'agit de transfections transitoires?

[LXR]

Une question, est-ce qu'il s'agit de transfections transitoires?

En effet dans ma réponse j'ai considéré que c'était des siRNA par habitude (donc transitoire par excellence), alors que ce sont peut-être des shRNA (transitoire ou stable)...

Greg

[invite8ea281e7]

Bonjour Doubar, bonjour Greg!

Hébien j'ai malheureusement fait ma première manip avant d'avoir lu vos réponses .

J'ai testé: cellules non traitées, "mock transfection" (=ayant subi le protocole de transfection, mais sans siRNA), contrôle positif (=GAPDH), contrôle négatif (acheté chez Dharmacon (comme le reste d'ailleurs)) et enfin siRNA test. Le tout en triplcat . J'ai suivi les recommandations de la firme pour débuter, soit 10nM final. J'ai traité les cellules pendant 48h, et 78h (de vendredi à lundi).

Mes remarques:

- ( oui, ce sont des transfections transitoires).

-je n'ai malheureusement pas de contrôle fluorescent ...à commander

-après 24h, le milieu des cellules traitées avec le siRNA test était tout jaune... adieu les résultats .
Penses-tu que renouveler le milieu éviterait ce problème? Même s'il ne contient pas d'antibios? Aussi, petit détail: tu utilises des tips stériles ET RNase-Free? Est-ce que les siRNA sont aussi fragiles que l'ARN?

-je n'ai aussi fait qu'une seule transfection/puits

- j'éspère retrouver mes cellules vivantes lundi ...et que la concentration utilisée donnera des résultats

Quant aux résultats, je vous tiendrai au courant!

Encore merci pour vos conseils, ce forum est vraiment super!!!

[LXR]

tu utilises des tips stériles ET RNase-Free?

Les transfections sont utilisées en culture cellulaire donc la stérilité des cônes est de rigueur. Si tu n'en as pas utilisé des stériles, ni transfecté sous une PSM, cela expliquerait :

-après 24h, le milieu des cellules traitées avec le siRNA test était tout jaune...

Qui est dû à une rapide acidification du milieu de tes cellules certainement causée par une contamination bactérienne. Tu as regardé tes boîtes au microscope pour observer s'il y avait une contamination? Le milieu jaune était-il trouble?

Est-ce que les siRNA sont aussi fragiles que l'ARN?

Ils sont assez fragiles, surtout à leurs extrémités qui sont simples brin (5'- et 3'-overhang) et donc sensibles aux exonucléases. La partie centrale du siRNA est logiquement plus stable que des ARNs simples brins puisqu'elle est double brin. Globalement ils sont donc plus stables, surtout que les compagnies conseillent de les stocker à -20°C (contre -80°C pour des ARNs) et à 4°C une fois qu'un aliquot est entamé pour éviter les cycles de congélation/décongélation.

Tiens-nous au courant,

Greg

[invite8ea281e7]

Je me disais bien pour la contamination... j'ai regardé au microscope, le milieu n'était pas trouble, mais il y avait une pellicule blanchâtre dans le fond... j'ai traité au l'eau de javel et aspiré le milieu.

Voilà voilà, la suite au prochain épisode

[invite9eab997a]

Bonsoir,
moi aussi je fais tout comme LXR
Je n'utilise pas d'OPTIMEM mais du DMEM pur et ca marche tres bien. Je plussoie sur le fait de changer le milieu après 4h, ca ne peut pas faire de mal.
Par contre, je vérifie toujours l'extinction en western blot au moins une fois. En effet, si tu n'as pas d'effet sur tes cellules c'est soit que ta transfection ne marche pas soit que la protéine que tu cibles n'est pas impliquée.
Bon courage!

[invitebc21e9ec]

Pellicule blanchatre dans ton petri et milieu jaune, c'est qu'il y a du monde là-dedans! :/
En ce qui me concerne je change le milieu de culture chaque jour après la transfection, avec du milieu de culture classique complet (serum, antibios si tu veux).
Par rapport à l'utilisation de milieu de culture normal (DMEM) plutôt que de l'opti, je suis d'accord que ca ne gène pas mais à condition de ne pas mettre d'antibios surtout et d'éviter le serum.
Sinon pour la stérilité de la manip, c'est important de bien nettoyer la hote avant (SDS2% et EtOH 90% plutôt que juste de l'EtOH 70%), de porter des gants si possible et d'utiliser de préférence de tips RNasefree... C'est peut-être un excès de protectionisme mais je pense que c'est important pour éviter d'avoir des manis non reproductible et de pas savoir si ca vient des produits ou de la manip...

[invite8ea281e7]

Petite remarque, je n'ai pas mentionné que je procède à une transfection "forward", c'est à dire que je place d'abord le siRNA+Lipofectamine en plaque 6 puits et que j'y dépose mes cellules 20 minutes après. Dans ce cas, mes cellules ont-elles eu le temps d'adhérer à la surface? Changer le milieu ne risquerait pas de les décoller?

[invite8ea281e7]

Merci Doubar pour les conseils/ à la stérilité!

[invitebc21e9ec]

Changer le milieu de culture après 4-6h n'est pas risqué si tu transfectes des cellules comme les A549 qui adhèrent en une demi-heure quasiment.
Sur des cellules en culture primaire (des cellules alvéolaires par exemple) il vaut mieux laisser 24h avant de changer le milieu, sinon tu vas en effet perdre une grosse proportion de cellules qui n'ont pas encore adhérées (très circulaires au miocroscope) et qui ont été transfectées (ou non).
Avant de changer un milieu il faut regarder la tête des cellules au microscope pour s'assurer qu'elles sont en 'bon état'.

[invitebc21e9ec]

Ils sont assez fragiles, surtout à leurs extrémités qui sont simples brin (5'- et 3'-overhang) et donc sensibles aux exonucléases. La partie centrale du siRNA est logiquement plus stable que des ARNs simples brins puisqu'elle est double brin. Globalement ils sont donc plus stables, surtout que les compagnies conseillent de les stocker à -20°C (contre -80°C pour des ARNs) et à 4°C une fois qu'un aliquot est entamé pour éviter les cycles de congélation/décongélation.

Tiens-nous au courant,

Greg

Juste un détail en revanche, je suis pas sûr mais il me semble que pour les siRNA fluorescents, ils conseillent de les stocker à -80C. (à confirmer)

[invite72c79406]

bonjour à tous,

est ce que qulqu'un save pourqoui le lipoectamine n'est pas efficace pour le transfection en milieu complet ( evec sérum)..?? par quel mécanisme le sérum inhibe son efficacité de tranfection??

merci d'avance si vous connaissez la réponse!

thanks

[inviteb1fdb745]

Bonjour,
j'aimerais savoir en quoi les antibiotiques sont-il toxiques pour les cellules lors de la transfections?
Merci