purif des proteines recombinantes apres coupure au facteur X

[invitec70194b7]

Bonjour,
J’ai une question concernant la production et la purification des proteines recombinantes.
Apres passage par la colonne Nickel pour récupérer la protéine recombinante (sachant que la chaperonne fait 50 Kd et ma proteine d’interet fait 25 Kd) comment dois-je procéder (après coupure au facteur X) pour récupérer le maximum de protéine et éliminer tous l’imidazole (l'imidazole est dangereux pour la suite de ma manip)?
Apres coupure au facteur X dois-je repasser par la colonne Nickel puis par une colonne Centricon (cut off de 10 Kd) pour éliminer l’imidazole ? Avez-vous une meilleure idée ?
Merci
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[Zellus]

Salut,

Qu'est-ce que tu appelles la chaperonne ? Tu peux détailler davantage ton protocole stp pour qu'on puisse t'aider plus facilement ? Merci.
Sinon, pour virer l'imidazole tu peux faire une dialyse.

[piwi]

Non pas de meilleure idée. Un centricon YM20 me semble bien pour éliminer l'imidazole. Si vous voulez bien tout éliminer il suffira de compéter en buffer quelques fois avant de récupérer votre fraction (sans assecher la colonne bien entendu). J'imagine que l'on peut aussi faire ça en dialyse mais je ne l'ai jamais fais en pratique, je ne vous le conseillerai donc pas.

Cordialement,
piwi

[invitec70194b7]

Salut,

Qu'est-ce que tu appelles la chaperonne ? Tu peux détailler davantage ton protocole stp pour qu'on puisse t'aider plus facilement ? Merci.
Sinon, pour virer l'imidazole tu peux faire une dialyse.

Bonjour

En réponse à ta question Zellus:
la carte de mon plasmide est comme suit: une Chaperonne située en 5' (appelée Trigger factor: cela facilite le bon repliement de ma proteine d'interet et augmente d'une facon tres significative la solubilité de la proteine recombinante) suivi d'un His-tag puis du site de coupure du Facteur Xa et à la fin le Multiple cloning site.
en résumé t'as : 5'-Chaperonne--Histag--FacteurXa--Proteine-3'
du coup si tu coupes avec le facteur X tu libères 2 fractions: La Chaperonne avec l'His tag (52 Kd) et la proteine d'interet (25 Kd).

Concernant la dialyse (sachant que ma protéine fait 25 Kd) est ce que je ne risque pas de perdre beaucoups de ma prot????

Merci pr vos réponses

[A voir en vidéo sur Futura]

[Zellus]

a carte de mon plasmide est comme suit: une Chaperonne située en 5' (appelée Trigger factor: cela facilite le bon repliement de ma proteine d'interet et augmente d'une facon tres significative la solubilité de la proteine recombinante) suivi d'un His-tag puis du site de coupure du Facteur Xa et à la fin le Multiple cloning site.
en résumé t'as : 5'-Chaperonne--Histag--FacteurXa--Proteine-3'
du coup si tu coupes avec le facteur X tu libères 2 fractions: La Chaperonne avec l'His tag (52 Kd) et la proteine d'interet (25 Kd).

Oh oh d'accord. C'est quoi le nom ton plasmide ?

Concernant la dialyse (sachant que ma protéine fait 25 Kd) est ce que je ne risque pas de perdre beaucoups de ma prot????

Tu as toujours un peu de perte en dialyse certes mais si tu utilises un boudin avec un cut-off de 10 000 Da y aura pas de problème.

[invitec70194b7]

Oh oh d'accord. C'est quoi le nom ton plasmide ?


Tu as toujours un peu de perte en dialyse certes mais si tu utilises un boudin avec un cut-off de 10 000 Da y aura pas de problème.

Salut Zellus
le nom du plasimde en question est: "pCold TF DNA"

pour ma proteine j'ai eu un resultat impressionnant, une grosse bande dans le surnagent.

mais j'ai eu un probleme au niveau de la conservation des clones utilisés (cryoconservation dans le glycerole à -80°C), quand je relance une culture (peu de temps apres) à partire du glyerole (le glycerole est fait à partire de la préculture dans laquelle je n'ai pas encore mis l'IPTG), là c'est surprise mes bacteries poussent (dans un milieu LB Ampicilline) mais ils produisent moins la proteine (on dirai qu'elles perdent l'induction par l'IPTG)??????? est ce qu'il y a quelqu'un qui a deja eu ce genre de probleme?????

Merci pr vos reponses

[Zellus]

le nom du plasimde en question est: "pCold TF DNA"

Merci pour l'info.

mais j'ai eu un probleme au niveau de la conservation des clones utilisés (cryoconservation dans le glycerole à -80°C), quand je relance une culture (peu de temps apres) à partire du glyerole (le glycerole est fait à partire de la préculture dans laquelle je n'ai pas encore mis l'IPTG), là c'est surprise mes bacteries poussent (dans un milieu LB Ampicilline) mais ils produisent moins la proteine (on dirai qu'elles perdent l'induction par l'IPTG)??????? est ce qu'il y a quelqu'un qui a deja eu ce genre de probleme?????

Il est conseillé de TOUJOURS repartir de bactéries fraîchement transformées.

[invitec70194b7]

Merci pour l'info.


Il est conseillé de TOUJOURS repartir de bactéries fraîchement transformées.

Avec plaisir Zellus!!!

tu veux dire que je dois changer de clone à chaque fois que je produit ma prot ?????

Dis moi pr la coupure au facteur X t'utilises combien d'Unités/µg de Prot, tu le fais à quel pH et à quelle Temperature ??????

Merci

[Zellus]

tu veux dire que je dois changer de clone à chaque fois que je produit ma prot ?????

Il faut que tu transformes de nouvelles bactéries compétentes la veille de ta purif. C'est le mieux à faire. Tu peux éventuellement garder ta boîte à 4°C 3-4 jours si tu veux refaire une culture après, mais pas plus.

Dis moi pr la coupure au facteur X t'utilises combien d'Unités/µg de Prot, tu le fais à quel pH et à quelle Temperature ??????

Désolé mais je n'ai jamais utilisé le facteur X. J'ai le site de clivage de la protéase du TEV sur toutes les protéines que j'utilise. Je sais juste qu'il faut faire plus attention avec le facteur X car, contrairement à la protéase du TEV, il a tendance à digérer également ta protéine.

[invitec70194b7]

Il faut que tu transformes de nouvelles bactéries compétentes la veille de ta purif. C'est le mieux à faire. Tu peux éventuellement garder ta boîte à 4°C 3-4 jours si tu veux refaire une culture après, mais pas plus.

d'accord, merci pr les conseilles

Désolé mais je n'ai jamais utilisé le facteur X. J'ai le site de clivage de la protéase du TEV sur toutes les protéines que j'utilise. Je sais juste qu'il faut faire plus attention avec le facteur X car, contrairement à la protéase du TEV, il a tendance à digérer également ta protéine.

me concernant j'ai que 3 possibilités: Facteur X, Thrombine ou HRV 3C protease

juste une petite correction sur la carte du plasmide: 5'--Histag--Chaperonne--Fact X-- MCS--3'

[Zellus]

me concernant j'ai que 3 possibilités: Facteur X, Thrombine ou HRV 3C protease

Ah oui en fait c'est la thrombine qui coupe un peu partout je voulais dire, pas le facteur X. En tout cas j'en n'ai pas entendu parler ...