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Causes d'échecs de la production de protéines recombinantes



  1. #1
    fifi16

    Causes d'échecs de la production de protéines recombinantes


    ------

    Salut,
    comment peut-on remédier aux échecs suivants pouvant survenir lors de la production des protéines recombinantes:
    _ La protéine est produite mais elle est toxique pour la cellule.
    _ Protéine surexprimée mais mal repliée.
    _ protéine produite mais elle est protéolysée.
    _ La protéine est produite mais on ne sait pas la détecter ou la purifier.
    _ La protéine est produite mais il existe aussi des protéines proches (homologues) produites par la cellules(endogènes).
    _ Problème particulier lié à l'utilisation de la protéine chez l'homme.
    Voilà, merci de me répondre.

    -----

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  3. #2
    Moumoutte

    Re : causes d'échecs de la production de protéines recombinantes

    Bonjour,

    vaste problème!
    D'autant qu'il y a peu d'explications sur les protéines et les cellules utilisées, je vais néanmoins tenter de te donner quelques pistes:

    Citation Envoyé par fifi16 Voir le message
    _ La protéine est produite mais elle est toxique pour la cellule.
    Il faut changer de cellule. L'hôte est mal adapté

    Citation Envoyé par fifi16 Voir le message
    _ Protéine surexprimée mais mal repliée.
    Il faut limiter l'expression de la protéine. Un mauvais repliement est souvent dû à un encombrement numéraire de la protéine.

    Citation Envoyé par fifi16 Voir le message
    _ protéine produite mais elle est protéolysée.
    Là aussi, je regarderai si je ne peux pas changer d'hôte.

    Citation Envoyé par fifi16 Voir le message
    _ La protéine est produite mais on ne sait pas la détecter ou la purifier.
    Il faudrait pouvoir lui ajouter un tag ou regarder d'un peu plus près sa séquence, c'est étonnant!!!!

    Citation Envoyé par fifi16 Voir le message
    _ La protéine est produite mais il existe aussi des protéines proches (homologues) produites par la cellules(endogènes).
    Changer d'hôte? Est-ce possible? Désolé, trop peu d'informations.

    Citation Envoyé par fifi16 Voir le message
    _ Problème particulier lié à l'utilisation de la protéine chez l'homme.
    Peut-être s'agit-il là de problème de modifications post-traductionnelles, par exemple. Là aussi, l'emploi de cellule hôte eucaryote peut pallier à ce genre de problème.


    Voilà, j'espère que ça t'aura aider

  4. #3
    piwi

    Re : causes d'échecs de la production de protéines recombinantes

    Je n'aurais pas tout à fait les mêmes réponses que le participant précédant. Cela ne veut pas dire qu'elles sont meilleures, juste qu'il faudra peut être faire le tri.
    Protéine toxique:
    En première intention on peut baisser la température de culture de sorte à ce que le métabolisme de la cellule ralentisse. Elles meurent moins vite et on a plus de protéines. On peut aussi diminiuer l'induction si l'expression est inductible.
    Enfin changer d'hôte peut être une solution.
    mauvais repliement.
    Là encore diminuer l'induction peut aider. Changer d'hôte peut être une solution. Il existe aussi des produits commerciaux qui aident à obtenir un rempliement correct après extraction.
    protéolyse.
    Utiliser une souche déplétée des principales protéases (souches type BL21)
    Changer d'hôte

    La protéine est produite mais on ne sait pas la détecter ou la purifier.

    Comment sait on qu'elle est produite alors?
    Sinon pour la purification le problème vient de la ségrégation en corps d'inclusions. C'est un souci de la la production en bactérie, la protéine est produite mais se retrouve dans la fraction insoluble. Baisser la température de culture et l'induction aide. Sinon il n'y a pas trop de solution miracle. Il existe un produit commercial qui aide à sortir les protéines de ces corps d'inclusion.

    La protéine est produite mais il existe aussi des protéines proches (homologues) produites par la cellules(endogènes)
    Il faut taguer la protéine.

    Problème particulier lié à l'utilisation de la protéine chez l'homme.
    Un vrai roman... Il faudrait que la question soit plus précise.
    Je sers la science et c'est ma joie.... Il parait.

  5. #4
    Zellus

    Re : Causes d'échecs de la production de protéines recombinantes

    Salut,

    J'apporte moi aussi quelques idées . Pour un problème donné, il peut y avoir plusieurs solutions et elles peuvent être utilisées en même temps. Tout dépend surtout de la protéine que tu purifies.

    Citation Envoyé par fifi16
    La protéine est produite mais elle est toxique pour la cellule.
    • faire une plus grande culture
    • induire moins (avec moins d'inducteur et/ou moins longtemps)
    • changer d'hôte

    Citation Envoyé par fifi16
    Protéine surexprimée mais mal repliée.
    • diminuer la température pendant l'induction
    • co-exprimer la protéine avec un (ou des) chaperon(s) moléculaire(s) (comme GroES/GroEL, DnaK ...)
    • ajouter des petites molécules dans le milieu de culture comme le sorbitol ou la glycine-bétaïne (que l'on appelle chaperons chimiques)

    Citation Envoyé par fifi16
    protéine produite mais elle est protéolysée.
    • utiliser des cellules exprimant peu de protéases
    • utiliser plus d'inhibiteurs de protéases lors de la lyse cellulaire
    • induire moins longtemps

    Citation Envoyé par fifi16
    La protéine est produite mais on ne sait pas la détecter ou la purifier.
    • comparer le lysat de cellules induites et non induites sur gel
    • faire des prélèvement à différents temps de l'induction pour voir quelle bande devient de plus en plus intense sur le gel
    • essayer différentes méthodes chromatographiques (échangeuse d'ions, interactions hydrophobes ...) et essayer de voir si l'on récupère cette bande
    Je sais pas vraiment si je réponds à la question là. C'était pas très clair ...

    Citation Envoyé par fifi16
    La protéine est produite mais il existe aussi des protéines proches (homologues) produites par la cellules(endogènes).
    • étiqueter la protéine
    • prendre un hôte où il n'y a pas d'homologue si possible

    Citation Envoyé par fifi16
    Problème particulier lié à l'utilisation de la protéine chez l'homme.
    Tu peux préciser s'il te plaît ?

  6. #5
    fifi16

    Re : Causes d'échecs de la production de protéines recombinantes

    D'abord merci à tous,
    c'est vrai que ma question était très vaste d'ailleurs moi-même je n'ai pas de précisions, néanmoins pour le dernier problème je pense qu'il s'agit des tests sur l'homme c'est à dire qu'une protéine qui est efficace sur un modèle murin ne l'ai pas ou l'ai moins sur l'homme donc comment peut-on mieux l'adapter? Mais encore une fois le prof n'a pas précisé le type de protéine, le vecteur ou le système d'expression (j’espère que j'ai été un peu plus claire).
    • comparer le lysat de cellules induites et non induites sur gel
    • faire des prélèvement à différents temps de l'induction pour voir quelle bande devient de plus en plus intense sur le gel
    • essayer différentes méthodes chromatographiques (échangeuse d'ions, interactions hydrophobes ...) et essayer de voir si l'on récupère cette bande
    Je sais pas vraiment si je réponds à la question là. C'était pas très clair ...
    Oui tu as répondu à ma question sauf que le premier point je ne l'ai pas très bien compris j'aimerai bien que tu me l'expliques, merci encore.

  7. A voir en vidéo sur Futura
  8. #6
    Zellus

    Re : Causes d'échecs de la production de protéines recombinantes

    Citation Envoyé par fifi16
    c'est vrai que ma question était très vaste d'ailleurs moi-même je n'ai pas de précisions, néanmoins pour le dernier problème je pense qu'il s'agit des tests sur l'homme c'est à dire qu'une protéine qui est efficace sur un modèle murin ne l'ai pas ou l'ai moins sur l'homme donc comment peut-on mieux l'adapter? Mais encore une fois le prof n'a pas précisé le type de protéine, le vecteur ou le système d'expression (j’espère que j'ai été un peu plus claire).
    OK. Ben je dirais :
    • changer d'hôte (problème possible au niveau des modifications post-traductionnelles comme l'a dit Moumoutte)
    • humaniser ta protéine parce qu'elle induit une réponse immunitaire chez l'homme (je pense notamment à l'humanisation d'anticorps mais ça peut aussi se faire pour d'autres protéines me semble-t-il)

    Citation Envoyé par fifi16
    Oui tu as répondu à ma question sauf que le premier point je ne l'ai pas très bien compris j'aimerai bien que tu me l'expliques
    Quand tu veux vérifier que tu exprimes bien ta protéine, la première chose que tu fais c'est un gel (SDS-PAGE). Si elle est bien produite, tu va observer une belle bande en bleu de Coomassie. Mais bien sûr comme contrôle tu dois aussi déposer sur ton gel du lysat de cellules prélevées dans la culture avant d'ajouter l'inducteur. Logiquement, la grosse bande n'est pas encore présente sur gel pour cet échantillon. Donc tu peux voir ainsi, en comparant les deux puits, à quelle taille apparaît ta protéine (à supposer que tu ne la connaissait pas, ce qui semblait être ta question, même si c'est bizarre ).
    En fait, le point que j'ai mentionné après, avec des prélèvements à différents temps, va dans le même sens. Ca se fait surtout la première fois où tu exprimes une nouvelle protéine. Ca permet de savoir combien de temps exactement il faut induire (1h, 3h ...) car au bout d'un certain temps on n'observe plus d'augmentation de la production. Et au bout d'un long moment on observe même une diminution de l'intensité de la bande car la protéine est dégradée. Il faut donc trouver l'équilibre pour avoir une bonne production sans qu'il y ait protéolyse.
    Et pour confirmer que la bande correspond bien à ta protéine, tu peux faire un WB si tu as les anticorps nécessaires. Tu fait ça surtout les premières fois où tu fais ta production, mais quand tu la fais en routine, tu peux te passer du WB. A noter cependant que certaines protéines s'expriment mal et on ne voit pas apparaître de grosse patate sur le gel. Il est donc préférable là de faire un WB à chaque fois que tu fais une culture.

    Bon voilà je m'arrête là. Ca fait déjà un gros pavet .

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  10. #7
    fifi16

    Re : Causes d'échecs de la production de protéines recombinantes

    Thanks zellus, j"ai compris et puis ce matin le prof a répondu à la question en cours et donc j'aimerai ajouter qq trucs:
    Concernant la protéine mal repliée, il a dit que des peptides signaux étaient utilisés afin de l'orienter vers le périplasme car il est moins réducteur que le cytoplasme (formation des ponts dissulfures) et enfin pour le problème lié à l'homme c'était surtout un problème de sécurité donc il faut s'assurer que le système d'expression n'est pas toxinogène par exemple.
    Voilà merci encore et bonne soirée.

  11. #8
    bodum

    Re : causes d'échecs de la production de protéines recombinantes

    Changer d'hôte peut être une solution. Il existe aussi des produits commerciaux qui aident à obtenir un rempliement correct après extraction. Pourrais-tu me donner plus d'information sur ces products ? Car je fait face au même pronlème.

    Sinon pour la purification le problème vient de la ségrégation en corps d'inclusions. C'est un souci de la la production en bactérie, la protéine est produite mais se retrouve dans la fraction insoluble. Baisser la température de culture et l'induction aide. Sinon il n'y a pas trop de solution miracle. Il existe un produit commercial qui aide à sortir les protéines de ces corps d'inclusion. -> pourrais tu me donner plus d'information à ce sujet ?

    Merci beaucoup et bon week-end

    Bodum

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