Pb échantillon gel Tris-Tricine

[invite71305e45]

Bonjour,

Je travaille sur un peptide inférieur à 3 KDa et je voulais le visualiser en western blot. Mais je rencontre un petit problème: lors de la migration en gel tris-tricine, mes échantillons se "reserrent")( dans mon gel de séparation. Pb de sels? Mes échantillons sont préparés avec des cellules fraîches et broyées directement dans le tampon d'échantillon. Si oui, puis-je dessaler en conservant les plus petits peptides?
Rq: une migration test pour le même type de gel (mêmes réactifs) a fonctionné avec d'autres échantillons (culots secs congelés d'autres cellules)...

Merci d'avance
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[piwi]

C'est quoi votre gel? Parce que 3KD c'est petit petit et qu'un gel 10% ne va sans doute pas permettre de bien séparer des polypeptides en dessous de 15-10KD

Pour le desalage je pense que ça va être compliqué, le plus petit cutoff en centricon est 3KD, vous allez donc perdre votre peptide. Pour la dialyse je ne sais pas, je ne l'ai jamais pratiqué, il y a peut être une solution de ce coté là en utilisant un truc semi perméable aux ions. Mais vous grattez directement vos cellules dans le Laemmli, c'est cela? Dans ce cas là pas de problème de sel.

Je n'ai pas bien compris votre gel test. Vous avez testé la même protéine mais issue d'autres cellules. C'est cela qu'il fallait comprendre?

Cordialement,
piwi

[invite71305e45]

On a utilisé un gel Tricine à 16,5% pour les peptides entre 1,5 et 25KDa. Le tampon d'échantillon est spécifique de ce type de gel (0,1M Tris-HCl, 2% ßMEE,20% glycérol, SDS 1%, 0,02% coomassie G250)ce n'est pas du laemmli (pour gel tris-glycine)mais oui on sonique directement dans le tampon. J'ai regardé aussi pour le dessalage...problématique.

Pour le gel test, on a juste contrôlé la migration dans un gel aussi concentré (coloration).

Cordialement,
Aozora

[Zellus]

Salut,

Tu es sûr que ce n'est pas plutôt ton gel qui est mauvais ? Tu n'as peut-être pas mis assez d'acrylamide, c'est des choses qui arrivent (et à moi le premier ). Tu as redéposé sur un autre gel pour voir si tu obtenais le même résultat ? Je ne pense pas que ce soit un problème de sels de l'échantillon, vu que des protéines après chromatographie migrent de la même manière à 20 mM ou 1 M de KCl par exemple. Et si c'est un problème de sels, ça doit plutôt venir de ton tampon de migration.

[A voir en vidéo sur Futura]

[piwi]

Une question stupide mais vous ne vous plantez pas en coulant votre gel? Genre séparation au dessus, concentration en dessous. Ca ne m'est jamais arrivé mais pourquoi pas après tout.

[invite71305e45]

Il y a peut être un problème avec l'acrylamide mais ca fait deux fois qu'on obtient le même résultat snif... Pour ce qui est du gel de stacking et du gel de concentration, on les coule successivement et en se réferant au protocole donc pas de pb de ce côté là...

[inviteb6144ea4]

Bonjour,

Pour la dialyse je ne sais pas, je ne l'ai jamais pratiqué, il y a peut être une solution de ce coté là en utilisant un truc semi perméable aux ions.

Je ne sais pas si j'apporte grand chose mais pour la dialyse avec un aussi petit peptide je crains que ça ne fonctionne pas (<3 kDa c'est très difficile)
Si vous pensez que c'est un problème de sel, pourquoi ne pas tenter de précipiter les protéines avec un solvant tel que l'acide perchlolrique qui ne précipite pas les sels? ça peut être une solution

Cordialement