Clonage

[inviteda4f6ff5]

Salut tout le monde,

Je commence actuellement une construction pour generer un nouveau modele de souris transgenique. J'en suis seulement a la construction du vecteur et je me pose la question suivante: Je dois effectuer un clonage d'un fragment d'environ 700pb dans un plasmide au niveau d'un site EcoRI. Ce fragment est lui meme issu d'une double digestion EcoRI.
Je voudrais savoir en quelles proportions je dois avoir mon insert et mon plasmide lineaire dans ma reaction de ligation et quelles sont les chances d'avoir le bon produit. En effet, je crains surtout que mon plasmide ne se referme sur lui meme... Y aurait il des techniques?

Merci d'avance

Nodo le nouveau.
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[piwi]

Vous pouvez utiliser la CIP (Calf Intestine alkaline Phosphatase) pour supprimer les phosphates des extrémités de votre plasmide. Ainsi, durant la ligation il ne pourra pas se refermer sur lui même et seuls pourrons transformer ceux qui n'auront pas été coupés ou ceux qui auront étés recircularisés en intégrant votre insert.
Dés lors, les quantités d'inserts ne sont plus très importantes si votre digestion est totale (à contrôler en transformant avec le plasmide ouvert sans ligation). En général ce que je fais c'est une photo avec un aliquote du plasmide et de l'insert et j'évalue les quantités à utiliser pour avoir autant de l'un que de l'autre.

Cordialement,
piwi

[inviteda4f6ff5]

Merci beaucoup! Et apparemment le traitement a la CIP de mon vecteur n'empechera pas la ligation evec l'insert de s'effectuer car il me semble que la ligase T4 peut liguer des terminaisons phosphorylees (celles de mon insert) aux terminaisons non phosphorylees (de mon vecteur).

A bientot!