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Colonies de bactéries




  1. #1
    nodo

    Colonies de bactéries

    Bonjour tout le monde,

    Je suis actuellement entrain d'effectuer une modification de BAC par recombinaison homologue dans la bactérie DH10B. Je viens de transformer mes bactéries qui contiennent le BAC avec le plasmide contenant la séquence que je veux insérer dans ce BAC. Après l'electroporation, mes bactéries ont poussées sur un milieu contenant des antibiotiques appropriés montrant que certaines ont bien intégrer le plasmide et que celui ci a du s'intégrer dans le BAC (le plasmide contient une origine de réplication qui ne lui permet pas de se répliquer de façon autonome dans ce type de bactéries).
    Pour en arriver a ma question : j'ai étalé les bactéries sur des boites LB-Agar-Antibio, j'ai fait des prep sur 12 colonies. J'ai testé la bonne insertion de mon ADN dans le BAC par PCR (avec des primers designés spécialement). Le problème est que j'ai tout et n'importe quoi. Cela me donne l'impression que mes colonies sont hétérogènes et contiennent différentes populations de bactéries. Est ce donc possible qu'une colonie récupérée sur un milieu LB Agar ne soit pas pure???

    Merci d'avance pour votre aide!

    Nodo

    -----


  2. Publicité
  3. #2
    gorben

    Re : Colonies de bactéries

    Salut,

    Es tu sur que ton BAC est en seul exemplaire dans la bacterie? C'est un probleme courant lors de la mutagenese de plasmide multicopie. Une seule copie va integrer l'ADN qui tu as electropore, du coup resultat positif en PCR mais un mix de pas mal de chose (plasmide vide vs modifie). La strategie est generalement de transformer en meme temps le plasmide a modifier et l'insert, et dans des proportions ou une bacterie sera transformee par un seul plasmide a la fois. Pas mal de mise au point en perspective !

    Apres, si ton BAC est simple copie, pas d'idee desole.

    A+

  4. #3
    nodo

    Re : Colonies de bactéries

    Merci pour ta réponse.

    Malheureusement il me semble (à confirmer) que les BAC possèdent une origine de réplication OriS qui maintient le nombre de copies à 1 par cellules...
    Une autre idée?

    Nodo


  5. #4
    gorben

    Re : Colonies de bactéries

    Salut,

    Pas forcement, certains BAC ont une origine modifiee pour augmenter le nombre de copie.

    A+

  6. #5
    nodo

    Re : Colonies de bactéries

    Je connais la boite d'ou viennent ces BAC, normalement c'est bien une origine OriS mais je vais quand meme demander pour m'en assurer.

  7. A voir en vidéo sur Futura

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