Questions de génétique PCR

[invitec46ec66d]

Bonjour,

Je suis un peu perdue dans 2 exercices de génétique :

1/ Dans un exercice on coupe un plasmide avec Eco R1 pour cloner une sequence d'ADN connue. Le problème c'est qu'aucun des sites qui entourent cette séquence n'existe dans le plasmide et on demande s'il est possible de contourner le problème à l'aide d'une PCR.

Bon j'veux bien amplifier la séquence à cloner avec la PCR mais je ne vois pas comment ça pourra lui donner des bouts cohésifs qui pourront l'insérer dans le plasmide ... Sinon on peut isoler la séquence avec un enzyme dont le site se rapproche de EcoR1 mais on utilise pas de PCR là.

2/ Dans un exercice on a réalisé des PCR sur des ADNc et des ADN génomiques. Chez le patient sain si on fait la PCR sur l'ADN génomique puis qu'on coupe avec EcoR1 on obtient 2 fragments alors que chez le malade ça reste tel quel. Hypothèse.

ça veut dire qu'il y a mutation chez le malade sur le site EcoR1 non ? sachant que les ADN sont de même taille il n'y a pas de délétion...


Si jamais vous aviez quelques pistes à me donner ...
Merci !
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[invitee863e61a]

Bonjour,

Je suis un peu perdue dans 2 exercices de génétique :

1/ Dans un exercice on coupe un plasmide avec Eco R1 pour cloner une sequence d'ADN connue. Le problème c'est qu'aucun des sites qui entourent cette séquence n'existe dans le plasmide et on demande s'il est possible de contourner le problème à l'aide d'une PCR.

Bon j'veux bien amplifier la séquence à cloner avec la PCR mais je ne vois pas comment ça pourra lui donner des bouts cohésifs qui pourront l'insérer dans le plasmide ... Sinon on peut isoler la séquence avec un enzyme dont le site se rapproche de EcoR1 mais on utilise pas de PCR là.

2/ Dans un exercice on a réalisé des PCR sur des ADNc et des ADN génomiques. Chez le patient sain si on fait la PCR sur l'ADN génomique puis qu'on coupe avec EcoR1 on obtient 2 fragments alors que chez le malade ça reste tel quel. Hypothèse.

ça veut dire qu'il y a mutation chez le malade sur le site EcoR1 non ? sachant que les ADN sont de même taille il n'y a pas de délétion...


Si jamais vous aviez quelques pistes à me donner ...
Merci !

1) Pour cette question , sache que toute l'amorce n'a pas besoin d'être identique à sa cible. On peut rajouter des séquences que l'on veut en 5' de l'amorce. J'espère que cela te donnera des idées
2) Pas mal

[invitec46ec66d]

Hum ... on fait une PCR avec des amorces qui ressemblent à la séquence de restriction de EcoR1 c'est possible ça ?

Mais une pcr ne forme pas de bouts cohésifs si ? A moins de mettre une amorce qui "déborde", je veux dire donc la partie du début ne se fixe pas ... ? Je ne sais pas trop je suis peut-être à côté là !

[invitee863e61a]

Hum ... on fait une PCR avec des amorces qui ressemblent à la séquence de restriction de EcoR1 c'est possible ça ?

Mais une pcr ne forme pas de bouts cohésifs si ? A moins de mettre une amorce qui "déborde", je veux dire donc la partie du début ne se fixe pas ... ? Je ne sais pas trop je suis peut-être à côté là !

C'est exactement cela! Une partie de l'amorce doit s'hybrider mais en amont on peut rajouter la séquence du site EcoRI

[A voir en vidéo sur Futura]

[invitec46ec66d]

Wahou merci beaucoup !

[invitec46ec66d]

Re-Bonjour,

Il y a une suite à l'exercice n°2 ... voilà on me demande ensuite de donner une manière de savoir dans quels tissus est exprimé ce gène.

J'hésite entre 2 possibilités :
- hydridation in situ de l'ARNm correspondant
- RT-PCR
Mais ça suppose qu'on prenne un échantillon de tous les tissus ... c'est peut-être beaucoup !

Enfin on nous dit compte tenu de l'hypothèse faite sur la nature du défaut (on a donc dit que c'était une mutation sur le site eco-R1) le résultat de l'expérience qu'on a proposé est-il le même chez le malade et chez le non malade ?

Et là, mon niveau en génétique étant assez médiocre ... je ne sais pas trop quoi répondre! Je me dis que si le malade est encore vivant la mutation ne doit pas être trop importante alors si on met une sonde elle pourait très bien aussi se fixer chez le malade sur l'ARNm puisqu'il n'y a pas besoin que tout soit apparié ...

Donc est-ce que je me trompe dans la méthode à employer ??


Merci d'avance!

[invite16ff4a55]

J'espère que quelqu'un saura répondre parce que je serai interressée par la réponse

[invitee863e61a]

Re-Bonjour,

Il y a une suite à l'exercice n°2 ... voilà on me demande ensuite de donner une manière de savoir dans quels tissus est exprimé ce gène.

J'hésite entre 2 possibilités :
- hydridation in situ de l'ARNm correspondant
- RT-PCR
Mais ça suppose qu'on prenne un échantillon de tous les tissus ... c'est peut-être beaucoup !

Enfin on nous dit compte tenu de l'hypothèse faite sur la nature du défaut (on a donc dit que c'était une mutation sur le site eco-R1) le résultat de l'expérience qu'on a proposé est-il le même chez le malade et chez le non malade ?

Et là, mon niveau en génétique étant assez médiocre ... je ne sais pas trop quoi répondre! Je me dis que si le malade est encore vivant la mutation ne doit pas être trop importante alors si on met une sonde elle pourait très bien aussi se fixer chez le malade sur l'ARNm puisqu'il n'y a pas besoin que tout soit apparié ...

Donc est-ce que je me trompe dans la méthode à employer ??


Merci d'avance!

- Si le résultat de l'expérience est identique entre sain et malade, ceci signifie que l'expérience ne permet pas de repérer l'effet de la mutation. Dans ton cas, le résultat sera différent seulement si la mutation influence le niveau d'expression du gène au moins dans certains tissus.

[piwi]

Ce que l'on fait est effectivement de prélever tous les organes et on les teste tous. La première approche consiste en une RT-PCR ou un northern blot pour voir grossièrement dans quel tissu s'exprime le gène. Puis ensuite on peut essayer une hybridation in situ de l'ARN (pas toujours facile à mettre au point) pour cibler plus précisément les cellules dans le tissu.

Une manière de détecter par RT-PCR les malades au milieu des personnes saines serait de faire une amorce dont l'extrémité 3' tombe juste sur le nucléotide muté. A ce moment la partie toute 3' de l'amorce ne peut pas s'hybrider chez les malades et est donc libre. Et ça c'est rédhibitoire pour la TAQ. Elle n'amplifie pas. Du coup, votre RT PCR marche chez les personnes saines et pas chez les malades. Ou le contraire...
Bien entendu, cette stratégie ne s'applique pas au HIS et au NB.

Cordialement,
piwi

[invitee863e61a]

Ce que l'on fait est effectivement de prélever tous les organes et on les teste tous. La première approche consiste en une RT-PCR ou un northern blot pour voir grossièrement dans quel tissu s'exprime le gène. Puis ensuite on peut essayer une hybridation in situ de l'ARN (pas toujours facile à mettre au point) pour cibler plus précisément les cellules dans le tissu.

Une manière de détecter par RT-PCR les malades au milieu des personnes saines serait de faire une amorce dont l'extrémité 3' tombe juste sur le nucléotide muté. A ce moment la partie toute 3' de l'amorce ne peut pas s'hybrider chez les malades et est donc libre. Et ça c'est rédhibitoire pour la TAQ. Elle n'amplifie pas. Du coup, votre RT PCR marche chez les personnes saines et pas chez les malades. Ou le contraire...
Bien entendu, cette stratégie ne s'applique pas au HIS et au NB.

Cordialement,
piwi

Dans ce cas ,vous séquencer pour confirmer que le résultat négatif de la PCR est bien lié à la présence de la mutation quand même non ?

[piwi]

La réponse que je donne est une réponse basée sur une propriété réelle de la PCR (plantez vous sur les deux derniers nucléotides 3' ou même sur seulement le dernier nucléotide d'une amorce, même longue. Le résultat est celui que je décris) mais qui reste théorique au niveau diagnostique. Je ne suis pas allé vérifier si une telle stratégie avait déjà mise en oeuvre.
Le problème du séquencage est qu'il faut cloner ce qui n'est pas toujours simple et qui n'est jamais rapide. En diagnostic ce qui se fait est la chose suivante:
On fait la PCR avec, au milieu du fragment, le site EcoRI unique. On digère avec l'enzyme et on regarde si on a un ou deux fragments. Mais il faut ajouter une étape de digestion (bon 1h c'est pas énorme).

Ce que l'on pourrait faire pour s'assurer que le système d'amplification fonctionne bien serait d'ajouter une troisième amorce dans le mix:
------------------------------------------------------------------->gène
----->--------------------------->----------------------<---------

Il y a un petit fragment qui sera toujours amplifié et un grand fragment qui ne sera amplifié que chez les malades ou les personnes saines selon les choix de l'experimentateur.
Le petit fragment vous sert à prouver qu'il y a bien de l'ADN dans votre tube et que le système d'amplification a fonctionné. Le grand fragment est votre résultat.

Enfin, on peut imaginer pas mal de choses. Ce ne sont que mes petites idées au petit matin. On peut sans doute faire mieux en prenant le temps.

Cordialement,
piwi

[invitec46ec66d]

Je vous remercie sincèrement de toutes ces indications !
ça me donne des idées j'espère être inspirée sur le problème que je vais avoir le jour-j de mon exam !