anti LC3 humain aucun marquage en Western blot

[invitea0dd6620]

Bonjour, est ce que quelqu'un a une experience de western blot sur extrait de cellules humaines avec l'anticorps de lapin anti human MAP LC3 beta (H-50) sc-28266 de chez santa cruz biotech (marqueur d'autophagie). Je ne sors aucune bande specifique vers les 16-18kDa attendus avec des extraits de HeLa pretraitées ou non pour favoriser l'autophagie. J'ai essayé avec du cerveau de souris (censé etre un bon temoin positif). Toujours rien à la bonne taille. La technique de western n'est pas en cause car le marquage actine est impecable. Le LC3 est sensible à la degradation, donc les extraits sont realisés en presence d'inhibiteurs de proteases.
Je bloque...
Merci de votre aide si vous avez l'experience avec cet anticorps.
-----

[Moumoutte]

Bonjour,

quel anticorps secondaire avez-vous utilisé?

+

[invitea0dd6620]

un donkey anti Rabbit Ig couplé à la HRP dilué au 1/10 000. Revelation ECL.

En faisant des essais sans anticorps primaire mais avec l'anticorps secondaire, il n'y a aucun marquage donc le secondaire n'accroche pas de manière non spécifique sur le blot

[LXR]

Bonjour,

Une autre personne avait eu un problème pour détecter LC3 en Western Blot : Anti-LC3. Etant donné qu'une personne de mon équipe fait des WB anti-LC3 de temps en temps et qu'ils marchent, je vous donne à vous aussi le lien commercial vers cet anticorps, par MP.

Greg

[A voir en vidéo sur Futura]

[invitea0dd6620]

Merci LXR, cet ab fonctionne en WB contrairement au premier que j'avais utilsé. J'ai fait un premier essai avec du cerveau de souris et j'ai bien un signal a 16-18kDa. Je ne distingue pas les deux isoformes sur mon premier essai mais je vais augmenter le % de PA.

[LXR]

Mon collègue fait un gel à 12.5% mais tu peux pousser jusqu'à 15% vu que les fragments sont de petite taille, tu auras une meilleure séparation.

Greg