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anti LC3 humain aucun marquage en Western blot



  1. #1
    P75

    Question anti LC3 humain aucun marquage en Western blot


    ------

    Bonjour, est ce que quelqu'un a une experience de western blot sur extrait de cellules humaines avec l'anticorps de lapin anti human MAP LC3 beta (H-50) sc-28266 de chez santa cruz biotech (marqueur d'autophagie). Je ne sors aucune bande specifique vers les 16-18kDa attendus avec des extraits de HeLa pretraitées ou non pour favoriser l'autophagie. J'ai essayé avec du cerveau de souris (censé etre un bon temoin positif). Toujours rien à la bonne taille. La technique de western n'est pas en cause car le marquage actine est impecable. Le LC3 est sensible à la degradation, donc les extraits sont realisés en presence d'inhibiteurs de proteases.
    Je bloque...
    Merci de votre aide si vous avez l'experience avec cet anticorps.

    -----

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  3. #2
    Moumoutte

    Re : anti LC3 humain aucun marquage en Western blot

    Bonjour,

    quel anticorps secondaire avez-vous utilisé?

    +

  4. #3
    P75

    Re : anti LC3 humain aucun marquage en Western blot

    un donkey anti Rabbit Ig couplé à la HRP dilué au 1/10 000. Revelation ECL.

    En faisant des essais sans anticorps primaire mais avec l'anticorps secondaire, il n'y a aucun marquage donc le secondaire n'accroche pas de manière non spécifique sur le blot

  5. #4
    LXR

    Re : anti LC3 humain aucun marquage en Western blot

    Bonjour,

    Une autre personne avait eu un problème pour détecter LC3 en Western Blot : Anti-LC3. Etant donné qu'une personne de mon équipe fait des WB anti-LC3 de temps en temps et qu'ils marchent, je vous donne à vous aussi le lien commercial vers cet anticorps, par MP.

    Greg
    Never give up.

  6. A voir en vidéo sur Futura
  7. #5
    P75

    Re : anti LC3 humain aucun marquage en Western blot

    Merci LXR, cet ab fonctionne en WB contrairement au premier que j'avais utilsé. J'ai fait un premier essai avec du cerveau de souris et j'ai bien un signal a 16-18kDa. Je ne distingue pas les deux isoformes sur mon premier essai mais je vais augmenter le % de PA.

  8. #6
    LXR

    Re : anti LC3 humain aucun marquage en Western blot

    Mon collègue fait un gel à 12.5% mais tu peux pousser jusqu'à 15% vu que les fragments sont de petite taille, tu auras une meilleure séparation.

    Greg

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