western-blot

[invite9ede8c9d]

Bonjour à toutes et tous,

je suis entrain de faire des western sur des mutants afin de voir la différence d expression d une protéine dans ces lignees. Or je suis obligé pour cela de précipiter mes protéines sinon je n ai pas les quantites suffisantes.

Or apres precipitation, j ai un culot important que je n arrive pas a reprendre dans le laemmli donc je ne suis pas sure de charger la meme quantite de prot sur chaque piste.

Connaitriez vous un moyen de dissoudre les culots ???

Autre petite question pour un clonage, je fais des ligations et je souhaite bien sur étalez toute ma transfo pour cela je centrifuge mes bacteries a 9000rpm pendant 1 min on me dit que cela abime mes bacteries est ce vrai ? moi je ne pense pas, c est solide ces petites bestioles

Merci d avance
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[invitea0443c8c]

Or apres precipitation, j ai un culot important que je n arrive pas a reprendre dans le laemmli donc je ne suis pas sure de charger la meme quantite de prot sur chaque piste.

La seule solution reste le dosage dans le laemmli et la normalisation avant de charger.

Un culot trop gros n'est pas forcément normal. Si tu as la même quantité de cellules au départ et que tu as un problème de différences à la fin c'est:
- soit une de tes lignée qui pousse plus/moins vite
- soit tu ne prends pas exactement la même quantité pour ta précipitation : essuis ton cône après l'avoir trempé dans ton lysat (avant de le précipiter), surtout si c'est visqueux, et surtout resuspends en aller/retour pendant une bonne minute (je suppose que tu précipites à l'éthanol)

V.

[gorben]

Salut,

Perso apres precipitation au TCA et lavage a l'acetone, je chauffe 2-3 min a 60°C pour secher le culot, puis je resuspend dans le laemmli et je chauffe encore quelques minutes a 60°C pour bien dissoudre (plus du vortex intensif).
Quand ca se dissout mal, c'est que j'ai trop seché mon culot.
Pour les bacteries, quand c'est tres important, je centrifuge a 4000g 10min (histoire d'etre sur de pas les eclater). Sinon en regle generale, c'est 20 sec a 16000g.... J'ai pas vu de difference flagrante entre les deux methodes.

A+

[invite9ede8c9d]

Ce n est pas un western sur protéine surexprimée en systeme procaryote mais sur des protéines issues de tissu..

Et donc avant ma précipitation on dose et je précipite la meme quantité environ 150 µg. C est apres ma précipitation ou j ai un culot que je n arrive pas a reprendre.. en effet c est peut etre que je fais trop chauffer ...

[A voir en vidéo sur Futura]

[invitea0443c8c]

Et bien donc, qu'est ce que ça donne en Western? tu as dit que tu avais une différence dans la taille des culots mais au niveau de la membrane ca donne quoi? Et sinon, question bête, as tu essayé de précipiter moins de 150µg? Tu peux très bien doser dans le laemli. Et je réitère mon conseil sur l'essuyage du cône quand tu précipites parce que ton erreur vient d'un problème dans ta précipitation.

V.

[invite9ede8c9d]

Ben en western j ai des bandes plus fortes pour certaines souches de droso pour cette proteine le pb c est que je ne peux pas affirmer que c est a cause de la surexpression de la prot dans ces souches ou seulement si j ai depose plus.
Je ne peux pas précipité moins car la prot est peu exprimée donc pour la detecter il m en faut un certain nombre. Ce que je fais aujourd hui je vais faire la tubuline pour voir si le niveau d expression est plus fort dans les pistes ou ma prot est plus exprimée si c est le cas c est que le depot de prot est plus important... Donc mes souches de droso ne surexpriment pas ma prot

[invitefe7212d1]

Bonjour,

Je fais également des western blot et j'ai le même problème que toi. je resuspend mes protéines directement dans le tampon de charge donc je ne peux pas quantifier la quantité de protéines que je dépose sur gel.

Par contre, pour quantifier j'utilise trois façons différentes :
tu peux utiliser les bandes aspécifiques présente sur ma membrane (s'il y en a),
tu peux couper ton gel en deux. Une partie de ton gel va être colorée au bleu de Coomassie et l'autre partie va être transférée sur membrane. tu peux grâce à la coloration au bleu déterminer si tu as déposé une quantité équivalente de protéines sur gel.
L'autre solution est d'hybrider ta membrane avec un second anticorps : qui va reconnaitre une protéine témoin (style l'actine si bien sur la taille de ta protéine témoin n'est pas la même que celle de ta protéine d'intérêt)!

Voilà, j'espère avoir pu t'aider
A bientôt

Lilie