bonjours,
Voilà je voulais savoir s' il est possible de faire un westren blot avec des proteines couplées à la peroxydase?
Et cela en faisant bien sur un western sans sds afin de ne pas dénaturer les proteines pour pouvoir révéler la peroxydase sur la membrane.
merci
Bonjour.
Tout à fait. C'est même cette méthode qui est générallement employée, ex:Envoyé par taida
- anticorps primaire souris
- anticorps secondaire anti souris couplé à la péroxidase
Je ne comprends pas bien. On peut tout à fait faire un western avec SDS et utiliser un anticorps couplé à la péroxydase. Le SDS agit pendant la migration mais une fois que les protéines sont sur la membrane, il n'y a plus de SDS et si il en reste il disparaît avec les lavages donc aucun problème pour la péroxydase (et d'ailleurs intuitivement ça coule de source car les anticorps que vous allez utiliser, avant la péroxydase, nescessitent leur conformation 3D ce qui prouve que le SDS ne bouleverse pas la manipe une fois que l'on est sur la membrane).
Maintenant vous pouvez tout à fait faire un gel non dénaturant sans SDS si vous voulez garder la conformation native des protéines et conserver les complexes, mais cela n'a rien à voir avec l'utilisation ultérieure d'un anticorps couplé à la préoxydase.
V.
Merci beaucoup de m'avoir répondu vinc,
Cependant je pense que je me suis mal expliqué, désolé.
En fait ce que je voulais savoir c'est s'il est possible de faire migrer sur gel une proteine couplée à la peroxydase puis de la transferer sur membrane et cela en condition non dénaturante pour que la peroxydase après avoir été blottée puisse encore réagir.
Ha d'accord désolé!
A priori si tu es non dénaturant tu dois conserver la structure et la fonction de la péroxydase donc j'aurai tendance à dire que c'est possible tout en sachant que la migration et le transfert vont certainement quand même abimer ta protéine. Il faut essayer.... tu me tiens au courant?
V.
J'ai essayé, et ça a marché!
par contre le signal était beaucoup trop fort, je n'ai donc pu réveler qu'une grosse tache noire. Demain j'essaie avec moins de protéine.
Génial! Ca m'intéresse pour une manipe future.... Je n'étais pas persuadé que la prot soit en bon état mais en fait si.....
Pour ton problème de signal : as tu essayé d'exposer moins longtemps ou de numériser (les caméras CCD sont moins sensibles que les films classiques et il faut plus d etemps pour voir un signal)?
V.
Pour ce qui est de numériser, malheureusement je n'en n'ai pas les moyens. Mais oui je vais essayer de l'exposer moins longtemps.
Encore merci pour tes conseils Vinc.
Pas de quoi...
V.
Bonjour Taida,
Je voudrais faire la même manip que toi. Quelle est la composition de ton tampon de transfert ? Tu as transféré tes protéines sur membrane avec le système Biorad ?
Merci d'avance pour ton aide.
