bonjour,
petite question à propos du western blot:
est il nécessaire d'ajuster le pH du tampon de transfert?
certains utilisent du tris base, d'autres du tris HCl: faut il ajuster seulement si on utilise du tris base ??
les protocoles trouvés sur internet sont tous différents!
merci de votre aide
Bonjour.
Je n'ajuste jamais le pH du tampon de transfert. Mon protocolle (que j'utilise tous les jours et qui fonctionne parfaitement):
Tampon 10x: 5 litres
- 150g de Tris base
- 716g de glycine
- H2O qsp 5 litres
A partir de là, pour un litre de tampon de transfert 1x:
- 80mL de tampon 10x (voir ci dessus)
- 200 mL de méthanol
- 720 mL d'H2O (qsp 1 litre)
Ne surtout pas autoclaver le 10x et le 1x, ça dégomme la glycine... Et pas besoin de prendre le pH.
V.
Primum non nocere.
pareil c'était du Tris base un peu la même composition que précédemment je n'ajusté pas le pH.
Si tu est vraiment très stricte quand au pH que tu a veu ça ne prend pas trop de temps de voir ton pH mais c'est pas d'une grande utilité c'est juste un tampon de transfert.
Si il n'y a pas de transfert revoit ta composition de ton tampon de transfert mais les compositions données sur le net ne posent pas de problème. Moi ça marché. Après tout dépend peut être de la taille de tes trucs à transférer.
Pour en remettre une chouche,
j'ai le même protocole que Vinc, je n'ajuste jamais le pH.
Cordialement,
piwi
Je sers la science et c'est ma joie.... Il parait.
Merci à tous pour vos conseils.
je vais tenter comme ça, on verra bien!
Salut,
Juste pour en remettre une couche moi aussi, il existe des tampons de transfert SANS methanol... c'est vachement mieux pour l'environnement ainsi que pour sa propre sante, et ca ca marche aussi bien ! En plus, il suffit de peser la poudre et de la diluer, et le tour est joue ! Ce compose s'appelle le CAPS (suivre le lien ici).
De plus le methanol peut etre facilement remplace par de l'ethanol voire supprime (sauf utilisation de membrane PVDF evidemment).
A+
Rapidement...pareil, pas d'ajustement de pH et remplacement du methanol par de l'ethanol. Le retrait de l'ethanol peut ameliorer le rendement de transfert de proteines de haut poids moleculaire. On peut supprimer l'ethanol avec les membranes de PVDF, pas conseille avec les membranes de nitrocellulose.Envoyé par gorben
salut
je relance le fil car j'ai un problème pour un WB d'une protéine de haut poid moléculaire et je pense que c'est le transfert qui cloche (en désespoir de cause)
j'utilise le même tampon mais avec de l'éthanol et une membrane PVDF
Si vous avez des suggestions, n'hésitez pas
Merci d'avance
Bonjour,
est ce que une personne peut m'aider.
Je dois faire des western blot sur proteine petit PM (20kDA), mais avant mon maitre de stage veut que j'optimise les conditions donc je fais juste des western avec la beta actine, et le transfert sur membrane ne marche jamais ! J'ai essayé 1h 100V (je mets 3 membranes pour vérifier) j'avais des bandes bleues sur les 3 membranes et encore des protéines sur mon gel, 2h 50V, pareil ! J'utilise le mm tampon de transfert que vous ... Je sais plus quoi faire !
Bonjour,
Pour répondre au dernier message, pour ma part lors des transferts de ma protéine de 26kDa que je faisais sur membrane PVDF avec le même tampon ou très très proche. Je ne dépassais pas les 25 V mais pendant 50 minute-1h. Maintenant, je t'avoue je n'ai jamais essayé autant de volt et temps pour un transfert. Et avec ce que je isais, je ne voyais plus de bande sur le gel ( ceci ne prouve pas non plus qu'il y avait plus rien, mais je savais que ce qu'il y avait était au moins en grande partie sur ma membrane).
Je me demande si c'est possible que avec le Temps et le voltage que tu mets, tes protéines ne passeraient pas au travers de ta membrane pour se retrouver dans le tampons moux ( je sais plus le nom) en dessous de ta membrane.
Je dis peut-être une connerie. Alors ne me taper pas et j'iraisi nécessaire.
Cordialement,
Droopx
