bonjour,
ça fait un petit moment où tout d'un coup mes blot deviennent flou.
les solutions sont les mêmes qu'utilisent mes collègues, que ce soit pour la fabrication du gel, ceux pour le transfert ou de révélation. je fais un petit gel à 10% qui migre 5h à 100 V à température ambiante.
à votre avis d'où peux venir le problème?
merci d'avance de vos suggestions!
Salut!
Tu migres à 100V mais à quel ampérage?
As-tu une photo du blot, qu'est ce que tu appelles "flou", manque de résolution des bandes??
V.
Primum non nocere.
à ampérage presque nul.
oui c'est ça excatement manque de résolution des bandes. ce n'est pas nette ce qui est accentué par la présence de bruit de fond.
Bonjour!
C'est bizzare. Quand je fais un petit gel à 10 %, il migre à 100 V 2 H maxi. Le problème vient peut-être du tampon trop faible en ions (vérifie les concentrations ainsi que les réactifs stocks) et peut-être aussi de ta cuve. Si les bandes sont floues c'est plus un problème de migration que de transfert je pense. Vérifie aussi les constituants de ton gel (si tu mets trop d'APS tu augmente la vitesse de polymérisation mais le gel est moins beau) et son homogénéité quand tu le coules.
De toute façon, un western, ça marche jusqu'au jour où cela ne marche plus alors qu'on procède de la même façon et là, on remet tout en cause sans pour autant trouver le problème. Crois-en mon expérience. Quand tu as un doute, tu recommences en priorité toutes les solutions puis tu vérifies si tu as changé de lot d'anticorps par exemple ou de référence de produit.
Bon courage.
Amicalement.
amicalement
emma
Ampérage presque nul c'est à dire??? Combien en mA?
Ca peut être pas mal de choses:
- prob dans le pH de tes buffers de gels
- prob dans l'acrylamide
- prob d'électrode
- prob dans la quantité de protéines
- prob dans le buffer de migration
- prob dans la dénaturation
- ....
Si tu n'as pas possibilité de faire de photo, je te conseille de refaire toutes tes sauces, de prendre de l'acrylamide neuve, et de réessayer avec plusieurs quantités de protéines en espacant chaque échantillon par un puit vide.
V.
Primum non nocere.
merci à tous
de toute manière dés lundi j'ai prévu de refaire toutes les solutions on ne sait jamais. ce sont des solutions stocks préparéés à chaque fois par un membre du labo donc on ne sait jamais surtout qu'on vient de me signaler un doute sur le tampon de migration préparé par 2 personnes différentes (donc y a déjà un doute). de toute façon on n'est jamais mieux servi que par soi-même!
merci encore à vous!
